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Posté par Publication le 28/08/2005 à 00:38
La microscopie en fluorescence

Le phénomène de fluorescence

Certaines substances, lorsqu'elles sont soumises à un faisceau électromagnétique dont la fréquence v est située dans la lumière visible ou l'ultraviolet, émettent un autre rayonnement de fréquence v' plus petite, donc moins énergétique. On dit que ces substances sont fluorescentes si cette émission se situe dans le domaine de la lumière visible (La lumière visible, appelée aussi spectre visible ou spectre optique est la partie du spectre électromagnétique qui est visible pour l'œil humain.).

Les molécules qui possèdent cette propriété de fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur. (on parle parfois de « lumière froide »). Elle peut servir à caractériser un matériau.) incluent dans leur structure des groupements chimiques appelés chromophores qui sont responsables de cette propriété (tels que benzène (Le benzène est un hydrocarbure aromatique monocyclique, de formule C6H6, également noté Ph-H, φ-H ou encore Ar-H. Ce composé organique incolore (il a...), C=O, C=C, C=S, C=N, C=C-C=O, C=C-C=C, N=N, N=O, NO2, S=O). Les plus fréquemment rencontrés dans les molécules organiques sont les noyaux benzéniques. Sous l'impact des photons (En physique des particules, le photon est la particule élémentaire médiatrice de l'interaction électromagnétique. Autrement dit, lorsque deux particules chargées électriquement...), le chromophore passe à un état excité, puis il revient à son état fondamental (En physique quantique, les états fondamentaux d'un système sont les états quantiques de plus basse énergie. Tout état d'énergie supérieure à celle des états fondamentaux est un état excité.) en émettant de la lumière (La lumière est l'ensemble des ondes électromagnétiques visibles par l'œil humain, c'est-à-dire comprises dans des longueurs...). La réponse est presque simultanée, ce qui la distingue de la phosphorescence, beaucoup plus persistante. Si l'on ne tient pas compte du délai (Un délai est d'après le Wiktionnaire, « un temps accordé pour faire une chose, ou à l’expiration duquel on sera tenu de faire une certaine chose.  ».) d'émission, fluorescence et phosphorescence sont regroupées sous le terme général de luminescence (La luminescence est une émission de lumière dite "froide", par opposition à l'incandescence qui elle est chaude.).

Il est possible de se servir du phénomène de fluorescence pour faire des images d'un objet (De manière générale, le mot objet (du latin objectum, 1361) désigne une entité définie dans un espace à trois dimensions, qui a une fonction précise, et qui...) (matière organique) en microscopie (La microscopie est l'observation d'un échantillon (placé dans une préparation microscopique plane de faible épaisseur) à travers le microscope. La microscopie permet de rendre visible des éléments invisibles à l'œil nu, soit...), s'il est différencié en régions dont certaines sont fluorescentes et d'autres pas. Ceci témoigne d'une différence de composition chimique entre ces régions. Si l'objet n'est pas naturellement fluorescent, une façon de le différencier en régions fluorescentes est de lui injecter un marqueur fluorescent qui diffuse dans l'échantillon (De manière générale, un échantillon est une petite quantité d'une matière, d'information, ou d'une solution. Le mot est utilisé dans différents...) et se fixe préférentiellement dans certains sites chimiques. Ces marqueurs sont appelés fluorochromes (tableau I). Dans une image, l'intensité variable (En mathématiques et en logique, une variable est représentée par un symbole. Elle est utilisée pour marquer un rôle dans une formule, un prédicat ou...) de l'émission fluorescente selon la localisation dans l'objet témoigne des différences dans la diffusion (Dans le langage courant, le terme diffusion fait référence à une notion de « distribution », de « mise à disposition » (diffusion d'un produit, d'une information), voire de...) et la fixation des marqueurs à l'intérieur de l'objet. En biologie (La biologie, appelée couramment la « bio », est la science du vivant. Prise au sens large de science du vivant, elle recouvre une partie des...) par exemple, on peut les lier à des anticorps qui vont se fixer de façon spécifique sur les antigènes correspondants (immunofluorescence). Très utilisés en biologie, les fluorochromes le sont peu dans les polymères et l'étude de leur spécificité reste à faire.


Tableau I: Les marqueurs fluorescents les plus courants et leur lumière d'excitation

Principe du microscope en fluorescence

Pour fonctionner en fluorescence, un microscope comprend une source lumineuse adéquate et un bloc interchangeable situé sur le trajet lumineux (figure 2). La source est constituée d'une lampe à vapeur () de mercure dont le rayonnement (Le rayonnement, synonyme de radiation en physique, désigne le processus d'émission ou de transmission d'énergie impliquant une particule porteuse.) est filtré en longueur (La longueur d’un objet est la distance entre ses deux extrémités les plus éloignées. Lorsque l’objet est filiforme ou en forme de lacet, sa longueur est celle de l’objet complètement...) d'onde (Une onde est la propagation d'une perturbation produisant sur son passage une variation réversible des propriétés physiques locales. Elle transporte de...) par le filtre (Un filtre est un système servant à séparer des éléments dans un flux.) d'excitation qui conserve une bande étroite du spectre lumineux. Ce faisceau est dévié vers l'échantillon par un miroir (Un miroir est un objet possédant une surface suffisamment polie pour qu'une image s'y forme par réflexion et conçu à cet effet....) dichroïque qui possède un fort coefficient (En mathématiques un coefficient est un facteur multiplicatif qui dépend d'un certain objet, comme une variable (par exemple, les coefficients d'un polynôme), un espace vectoriel, une fonction de base et...) de réflexion pour cette fenêtre (En architecture et construction, une fenêtre est une baie, une ouverture dans un mur ou un pan incliné de toiture, avec ou sans vitres.) de longueur d'onde et un fort coefficient de transmission pour la bande qui correspond au rayonnement fluorescent émis par l'échantillon. Ce rayonnement émis est sélectionné ensuite par un filtre barrière. Le filtre d'excitation, le miroir dichroïque et le filtre barrière, assemblés dans un seul bloc, peuvent être changés et choisis pour être spécifiques du fluorochrome utilisé.


Figure 2: Schéma de fonctionnement d'un microscope en fluorescence

Observation des arborescences en fluorescence propre

Lorsqu'on observe en fluorescence une arborescence qui n'a pas été marquée d'un fluorochrome, on recueille toutefois une image de faible intensité (figure 3). Cela indique que les arborescences ont leur fluorescence propre. Or le polyéthylène ne comprend pas de groupement chimique fluorescent. Une modification chimique du polyéthylène a donc eu lieu à cet endroit, probablement une oxydation sous l'effet de l'eau (L’eau est un composé chimique ubiquitaire sur la Terre, essentiel pour tous les organismes vivants connus.) salée et du champ électrique (Dans le cadre de l'électromagnétisme, le champ électrique est un objet physique qui permet de définir et éventuellement de mesurer en tout point de l'espace l'influence exercée à distance par des particules chargées électriquement.).


Figure 3: Arborescence en autofluorescence
Cliché E. Moreau et A. Boudet - Crédit photo IEEE

Observation des arborescences avec un marqueur fluorescent

Améliorons le contraste et la visibilité (En météorologie, la visibilité est la distance à laquelle il est possible de distinguer clairement un objet, quelle que soit l'heure. On peut mesurer la...) de l'arborescence en imprégnant la tranche de polyéthylène avec de la rhodamine, fluorochrome qui absorbe la lumière verte et émet de la lumière rouge (La couleur rouge répond à différentes définitions, selon le système chromatique dont on fait usage.). L'image obtenue présente un très bon contraste (figure 4). On constate une parfaite concordance dans l'étendue de l'arborescence sur les deux vues, mais les informations données (Dans les technologies de l'information (TI), une donnée est une description élémentaire, souvent codée, d'une chose, d'une transaction d'affaire,...) sont de natures différentes: dans la figure 4, la fluorescence provoquée est liée à la densité (La densité ou densité relative d'un corps est le rapport de sa masse volumique à la masse volumique d'un corps pris comme référence. Le corps de référence est l'eau pure à...) de la rhodamine, donc à la façon dont elle a pu se répandre à travers les craquelures et s'y fixer.


Figure 4: Arborescence d'eau observée en microscopie à fluorescence
Même zone que celle de la figure 3 après imprégnation de rhodamine
Cliché E. Moreau et A. Boudet - Crédit photo IEEE

La forme générale de l'arborescence est bien visible et sa structure interne (En France, ce nom désigne un médecin, un pharmacien ou un chirurgien-dentiste, à la fois en activité et en formation à l'hôpital ou en cabinet pendant une durée variable selon le...) beaucoup plus détaillée que sans marqueur. On distingue plusieurs fuseaux divergents. Il est aisé de focaliser l'observation sur l'extrémité d'un fuseau et d'augmenter le grandissement (figure 5). On remarque qu'un fuseau est constitué de micro-canaux entrelacés et sinueux. Leur largeur (La largeur d’un objet représente sa dimension perpendiculaire à sa longueur, soit la mesure la plus étroite de sa face. En...) est proche de la résolution du microscope, inférieure à 0,5 µm. L'observation est cependant gênée par le flou qui provient des plans se trouvant en-dehors de la mise au point (Graphie). Ce défaut disparaîtra avec l'utilisation de la microscopie confocale.


Figure 5. Détail d'un fuseau d'arborescence
Cliché E. Moreau et A. Boudet
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