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Posté par Publication le 28/08/2005 à 00:38
Le microscope confocal à balayage laser (CLSM)
Le microscope confocal est né suite à des études en optique effectuées par Minsky dans les années 1960, aboutissant à un brevet, peu remarqué à l'époque. Des chercheurs tels que Wilson en Angleterre, Sheppard en Australie et Brakenhoof en Hollande ont expérimenté des systèmes de microscopes confocaux à la fin des années 70, mais c'est seulement avec le développement des lasers et des ordinateurs que le principe a pu réellement être mis en pratique, démontrer toutes ses potentialités et se développer commercialement à la fin des années 80 (figure 6).


Figure 6: Un microscope confocal, le microscope Leica TCS SP2 RS

Le microscope confocal est une adaptation du microscope optique (L'optique est la branche de la physique qui traite de la lumière, du rayonnement électromagnétique et de ses relations avec la vision.) conventionnel dans laquelle la source lumineuse et le détecteur (Un détecteur est un dispositif technique (instrument, substance, matière) qui change d'état en présence de l'élément ou de la situation pour lequel il a été spécifiquement conçu.) sont réduits aux dimensions (Dans le sens commun, la notion de dimension renvoie à la taille ; les dimensions d'une pièce sont sa longueur, sa largeur et sa profondeur/son épaisseur, ou bien son diamètre si c'est une pièce de...) d'un point (Graphie), à l'aide de diaphragmes de quelques micromètres, situés en position confocale, ce qui veut dire qu'ils ont le même foyer optique (figure 7). Le faisceau lumineux émis est rendu (Le rendu est un processus informatique calculant l'image 2D (équivalent d'une photographie) d'une scène créée dans un logiciel de...) fortement convergent ( en astronautique, convergent en mathématiques, suite convergente série convergente ) par la lentille objectif pour éclairer seulement une zone réduite de l'objet (De manière générale, le mot objet (du latin objectum, 1361) désigne une entité définie dans un espace à trois dimensions, qui a une fonction précise, et qui peut être désigné par une étiquette verbale. Il est défini par les...). Cela a l'avantage d'éviter la diffusion (Dans le langage courant, le terme diffusion fait référence à une notion de « distribution », de « mise à disposition » (diffusion d'un produit, d'une information),...) lumineuse provenant des zones voisines. Dans le mode transmission, l'image de ce point est formée par la lentille collectrice sur le diaphragme du détecteur. Celui-ci mesure l'intensité reçue. Les deux lentilles sont ainsi réglées en position symétrique, dans laquelle la source, la région ponctuelle de l'objet, et le détecteur sont conjugués. La configuration du microscope la plus courante commercialement est le mode en réflexion (figure 8). Dans ce mode, c'est la même lentille qui sert pour focaliser la source et faire l'image sur le détecteur.


Figure 7: Principe de confocalité, source et détecteur sont deux points conjugués

Dans le mode en réflexion (figure 8), un miroir (Un miroir est un objet possédant une surface suffisamment polie pour qu'une image s'y forme par réflexion et conçu à cet effet. C'est souvent une couche métallique fine, qui, pour être protégée, est...) semi-réfléchissant renvoie le faisceau réfléchi vers le détecteur. La source est souvent constituée d'un laser (Un laser est un appareil émettant de la lumière (rayonnement électromagnétique) amplifiée par émission stimulée. Le terme laser provient de l'acronyme anglo-américain...), dont le faisceau est balayé en x et en y sur l'objet. Le détecteur recueille l'image en deux dimensions point par point. D'où le nom qu'on précise quelquefois de microscope confocal à balayage laser (MCBL en français ou CLSM en anglais pour Confocal Laser Scanning Microscope). Puis la platine (Le platine est un élément chimique de symbole Pt et de numéro atomique 78.) porte-objet est déplacée en z d'un pas défini constant de delta z, et à chaque avancée d'un pas une image xy est enregistrée dans la mémoire (D'une manière générale, la mémoire est le stockage de l'information. C'est aussi le souvenir d'une information.) de l'ordinateur (Un ordinateur est une machine dotée d'une unité de traitement lui permettant d'exécuter des programmes enregistrés. C'est un ensemble de circuits électroniques permettant de...). On acquiert donc un fichier ( Un fichier est un endroit où sont rangées des fiches. Cela peut-être un meuble, une pièce, un bâtiment, une base de données informatique. Par exemple : fichier des patients d'un médecin, fichier des...) numérique (Une information numérique (en anglais « digital ») est une information ayant été quantifiée et échantillonnée, par opposition à une...) à trois dimensions constitué de l'intensité de chaque point x, y, z (appelé voxel au lieu de pixel (Le pixel, souvent abrégé px, est une unité de surface permettant de mesurer une image numérique. Son nom provient de la locution anglaise picture...), c'est-à-dire élément de volume (Le volume, en sciences physiques ou mathématiques, est une grandeur qui mesure l'extension d'un objet ou d'une partie de l'espace.) au lieu de élément d'image). C'est la caractéristique de cet appareil de fournir une représentation en volume de l'objet sans avoir à le couper en tranches fines. Cependant, même en réflexion, le faisceau laser doit pénétrer dans la matière (La matière est la substance qui compose tout corps ayant une réalité tangible. Ses trois états les plus communs sont l'état solide, l'état liquide,...) et des pertes de lumière (La lumière est l'ensemble des ondes électromagnétiques visibles par l'œil humain, c'est-à-dire comprises dans des longueurs d'onde de 380nm (violet) à 780nm...) se produisent sur les trajets aller retour. En conséquence, l'épaisseur de la partie explorée de l'objet est limitée par son degré (Le mot degré a plusieurs significations, il est notamment employé dans les domaines suivants :) de transparence (Un matériau ou un objet est qualifié de transparent lorsqu'il se laisse traverser par la lumière. Cette notion dépend de la longueur d'onde de la lumière : ainsi, le verre est...). En pratique elle peut aller jusqu'à 10 ou 100 µm, quelquefois 200 µm.


Figure 8: Schéma du microscope confocal

Enfin, un traitement d'images exploite les données (Dans les technologies de l'information (TI), une donnée est une description élémentaire, souvent codée, d'une chose, d'une transaction d'affaire, d'un événement, etc.) du fichier et affiche des vues diverses (figure 9). On peut ainsi afficher les vues xy successives, mais on peut aussi faire leur somme et des projections stéréo, comme on le verra plus loin dans le cas des arborescences. Des logiciels puissants sont également capables de fournir l'apparence d'un objet vu en perspective dans l'espace


Figure 9: Reconstitution d'images en 3D et représentations possibles
en coupes optiques horizontales, coupes transverses ou obliques, vues stéréo

L'intérêt essentiel du microscope confocal réside dans sa résolution dans le sens (SENS (Strategies for Engineered Negligible Senescence) est un projet scientifique qui a pour but l'extension radicale de l'espérance de vie humaine. Par une...) de la hauteur (La hauteur a plusieurs significations suivant le domaine abordé.). Il est capable de sélectionner le signal ( Termes généraux Un signal est un message simplifié et généralement codé. Il existe sous forme d'objets ayant des formes particulières. Les signaux lumineux sont employés depuis la...) qui provient de la zone de mise au point en excluant les contributions des zones situées au-dessus et en-dessous. On réalise ainsi une coupe de l'objet par une astuce optique. La pièce maîtresse de cette fonction est le diaphragme ponctuel (En géométrie, un point est le plus petit élément constitutif de l'espace de travail.) placé devant le détecteur. C'est lui qui élimine les faisceaux issus des plans hors focalisation, grâce au principe de confocalité.

La résolution ou pouvoir séparateur est la distance de séparation (D'une manière générale, le mot séparation désigne une action consistant à séparer quelque chose ou son résultat. Plus particulièrement il est employé dans plusieurs domaines :) en-dessous de laquelle deux objets semblent confondus. Celle du microscope confocal est meilleure que celle du microscope conventionnel. Pour le microscope conventionnel, la résolution latérale dépend de l'ouverture de la lentille objectif et dans le meilleur cas, on peut espérer avoir un pouvoir séparateur de 0,4 µm. Cela n'empêche pas de voir des objets plus petits, mais ils seront vus plus gros que leur taille réelle, à la manière d'une lampe qui brille au loin dans la nuit. On distingue la lumière émise, mais pas la lampe elle-même. La résolution latérale du microscope confocal est liée également à l'ouverture de l'objectif, et aussi à la taille de la sonde (Une sonde spatiale est un vaisseau non habité envoyé par l'Homme pour explorer de plus près des objets du système solaire et, pour certaines, l'espace qui est...) laser et à la taille du diaphragme du détecteur. En mode par réflexion sans fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur. (on parle parfois de « lumière froide »). Elle peut...), elle peut descendre jusqu'à 0,15 µm. En mode en fluorescence cependant, à cause de l'incohérence du faisceau recueilli, elle reste équivalente à celle du microscope conventionnel. En fait, c'est la résolution en hauteur qui caractérise surtout le microscope confocal. Elle dépend aussi de l'objectif et peut atteindre 0,23 µm dans le meilleur des cas. Le pas delta z de balayage de la platine est réglé mécaniquement et indépendant de la résolution optique en z. Si on le choisit égal à la moitié de la résolution, on recueille alors le maximum d'informations. Si on n'a pas besoin (Les besoins se situent au niveau de l'interaction entre l'individu et l'environnement. Il est souvent fait un classement des besoins humains en trois grandes catégories : les besoins primaires,...) de cette résolution, il est inutile de le choisir aussi petit, car cela aurait l'inconvénient de grossir inutilement les fichiers numériques.
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