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Posté par Publication le 28/08/2005 à 00:38
Matériaux observés en fluorescence

Arborescences d'eau observées en microscopie confocale

Dans une arborescence d'eau traitée à la rhodamine, on a enregistré une série de coupes optiques espacées en hauteur de 0,3 µm. Trois d'entre elles sont exposées dans la figure 14. La netteté de l'image est remarquable. Elle est dénuée de tout (Le tout compris comme ensemble de ce qui existe est souvent interprété comme le monde ou l'univers.) flou de diffusion (Dans le langage courant, le terme diffusion fait référence à une notion de « distribution », de « mise à disposition » (diffusion d'un produit, d'une information), voire de...).




Figure 14. Coupes optiques d'arborescences aux profondeurs 2,4 µm, 3 µm, et 5,4 µm
Cliché E. Moreau et A. Boudet

Les micro-canaux des arborescences sont vus avec précision. Ils présentent un tracé enchevêtré et erratique, et on peut les observer d'un plan à l'autre, se développant en trois dimensions. On peut visualiser la projection (La projection cartographique est un ensemble de techniques permettant de représenter la surface de la Terre dans son ensemble ou en partie sur la surface plane d'une carte.) totale de ces plans en faisant la somme des images successives (voir la figure 9 ci-dessus, section "Le microscope confocal à balayage laser (Un laser est un appareil émettant de la lumière (rayonnement électromagnétique) amplifiée par émission stimulée. Le terme laser provient de l'acronyme...)"). Dans ce cas, bien qu'on ait perdu la troisième dimension (Dans le sens commun, la notion de dimension renvoie à la taille ; les dimensions d'une pièce sont sa longueur, sa largeur et sa profondeur/son épaisseur, ou...), il reste l'avantage, par rapport à la microscopie (La microscopie est l'observation d'un échantillon (placé dans une préparation microscopique plane de faible épaisseur) à travers le microscope. La microscopie permet de rendre visible des éléments...) non confocale, d'avoir éliminé tout le flou dû à des parties hors focalisation. On obtient une image de mise au point (Graphie) bien plus étendue en épaisseur. Il est d'ailleurs possible d'obtenir une paire (On dit qu'un ensemble E est une paire lorsqu'il est formé de deux éléments distincts a et b, et il s'écrit alors :) de vues stéréo (figure 15). Il suffit d'additionner les plans obliquement, comme si on regardait de côté, à gauche et à droite (figure 9). On reconstitue l'impression de relief (Le relief est la différence de hauteur entre deux points. Néanmoins, ce mot est souvent employé pour caractériser la forme de la surface de la Terre.) en les regardant séparément par chacun des deux yeux, par exemple en les séparant avec une feuille (La feuille est l'organe spécialisé dans la photosynthèse chez les végétaux supérieurs. Elle est insérée sur les tiges des plantes au niveau des nœuds. À l'aisselle de la...) de carton, ou en s'aidant d'une lunette appropriée. On peut enfin reconstituer des sections transverses en sélectionnant dans chaque coupe horizontale la ligne d'intersection avec le plan de section.


Figure 15: Vues stéréo, faites de la somme de 10 coupes horizontales
Cliché E. Moreau et A. Boudet

Fibres de verre (Le verre, dans le langage courant, désigne un matériau ou un alliage dur, fragile (cassant) et transparent au rayonnement visible. Le plus...) dans un matrice polyépoxyde

Des composites à matrice polymère chargée de particules, ou de corps dont la fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur. (on parle parfois de « lumière froide »). Elle peut servir à caractériser...) se distingue de celle de la matrice, peuvent être observés en fluorescence propre si la taille de ces corps est adéquate et si leur concentration n'est pas trop élevée. Dans la figure 16, des fibres de verre orientées parallèlement incluses dans une matrice polyépoxyde ont été tranchées en section transversale et observées en microscopie confocale par autofluorescence à trois profondeurs différentes. Elles sont très visibles et auréolées d'un anneau brillant dû à la fluorescence propre du produit d'ensimage des fibres, graisse (La graisse est un corps gras se présentant à l'état solide à température ordinaire. Le terme s'oppose aux huiles qui se présentent sous forme...) de protection dont elles sont enduites pour favoriser leur manipulation et leur adhésion (En physique, l'adhésion est l'ensemble des phénomènes physico-chimiques qui se produisent lorsque l’on met en contact intime deux matériaux, dans le but de créer une...) à la matrice. On distingue une fissure qui s'évase de la profondeur vers la surface (Une surface désigne généralement la couche superficielle d'un objet. Le terme a plusieurs acceptions, parfois objet géométrique, parfois frontière physique, et est...). Contrairement au microscope conventionnel, le microscope confocal a permis d'éliminer de l'image les stries de surface dûs au passage de la scie (Une scie est un outil destiné à couper le bois ou d'autres types de matériaux, constituée d'une lame dentée et actionnée par diverses moyens tels que la main, l'électricité, l'eau, etc.), car elles restent en-dehors des plans de focalisation.




Figure 16: Fibres de verre dans une matrice polyépoxyde, coupes optiques en surface, à 5 et 10 µm de profondeur
Microscopie confocale en fluorescence
Reproduit d'après Thomason et Knoester, Journal of Material Science (La science (latin scientia, « connaissance ») est, d'après le dictionnaire Le Robert, « Ce que l'on sait pour l'avoir appris, ce que l'on tient pour vrai au sens large. L'ensemble de...) Letter, 1990
Crédit photo: Chapman and Hall

Émulsions et gels. Images dans le milieu liquide

La microscopie confocale est particulièrement intéressante dans les émulsions et les gels, constitués de substances solides ou visqueuses dispersées dans l'eau (L’eau est un composé chimique ubiquitaire sur la Terre, essentiel pour tous les organismes vivants connus.).

Pour faire l'image en fluorescence des émulsions, il est souvent indispensable de recourir à un marqueur fluorescent qui va imprégner spécifiquement l'un des composants. Les émulsions de nourriture (fromage blanc (Le blanc est la couleur d'un corps chauffé à environ 5 000 °C (voir l'article Corps noir). C'est la sensation visuelle obtenue avec un spectre lumineux...) frais, sauces, crèmes, ...) sont fréquemment composées d'une phase (Le mot phase peut avoir plusieurs significations, il employé dans plusieurs domaines et principalement en physique :) aqueuse et d'une phase grasse qui absorbent chacune un marqueur différent. On peut marquer l'une ou l'autre, mais comme les microscopes confocaux disposent souvent de deux sources lasers avec deux longueurs d'onde (Une onde est la propagation d'une perturbation produisant sur son passage une variation réversible des propriétés physiques locales. Elle transporte de l'énergie sans transporter de matière. Une onde transporte...) différentes, il est possible de marquer les deux, d'exciter les deux fluorochromes chacun dans leur longueur (La longueur d’un objet est la distance entre ses deux extrémités les plus éloignées. Lorsque l’objet est filiforme ou en forme de lacet, sa longueur est celle de l’objet...) d'onde caractéristique, de former une image recueillant les deux émissions fluorescentes séparément, puis de les superposer dans une image bicolore (Le bicolore est un lépidoptère appartenant à la famille des Notodontidae.) (les couleurs sont alors arbitraires dans la représentation sur l'écran).

Les gels sont constitués d'un liquide stabilisé par un réseau (Un réseau informatique est un ensemble d'équipements reliés entre eux pour échanger des informations. Par analogie avec un filet (un réseau est un...) macromoléculaire, autrement dit des molécules de polymères en très faible quantité (La quantité est un terme générique de la métrologie (compte, montant) ; un scalaire, vecteur, nombre d’objets ou d’une autre manière de dénommer la valeur d’une collection ou un...) (environ 2 à 5 %). Si l'on dispose d'un marqueur qui se fixe sur ce réseau, on obtient l'image du réseau au sein (Le sein (du latin sinus, « courbure, sinuosité, pli ») ou la poitrine dans son ensemble, constitue la région ventrale...) du liquide. L'avantage est évident par rapport à la microscopie électronique par exemple, qui nécessite l'extraction de la phase liquide avec le risque d'effondrement du réseau. Elle n'a pas la lourdeur de techniques de microscopie électronique plus élaborées qui nécessitent de congeler le liquide pour le conserver. Par contre la résolution est plus faible. Le problème est de savoir quel est le bon marqueur et de quelle façon il va se fixer sur le réseau, en espérant qu'il n'induise pas de modifications de structure.

Une paire d'images stéréo d'un réseau de fibrine coagulé dans l'eau est présentée dans la figure 17. Il a été rendu (Le rendu est un processus informatique calculant l'image 2D (équivalent d'une photographie) d'une scène créée dans un logiciel de modélisation 3D comportant à la fois des objets et des sources de lumière...) fluorescent par l'addition (L'addition est une opération élémentaire, permettant notamment de décrire la réunion de quantités ou l'adjonction de grandeurs...) de FITC. La fibrine est visible sous forme de fibres cylindriques de diamètre (Dans un cercle ou une sphère, le diamètre est un segment de droite passant par le centre et limité par les points du cercle ou de la sphère. Le diamètre est aussi la longueur de ce...) variable (En mathématiques et en logique, une variable est représentée par un symbole. Elle est utilisée pour marquer un rôle dans une formule, un prédicat ou un...), entremêlées selon un maillage plus ou moins dense.


Figure 17: Gel de fibrine, vues stéréo, microscopie confocale en fluorescence
Les images ont été réalisées en additionnant 30 coupes optiques espacées de 1 µm
Extrait de Blombäck, Carlsson, Lepault, McDowall, Nature, 1984

Mousses

Le microscope confocal accepte aussi les mousses, type mousse à raser, dispersion (La dispersion, en mécanique ondulatoire, est le phénomène affectant une onde dans un milieu dispersif, c'est-à-dire dans lequel les différentes fréquences constituant l'onde ne se propagent pas à la...) de cavités de gaz (Un gaz est un ensemble d'atomes ou de molécules très faiblement liés et quasi-indépendants. Dans l’état gazeux, la matière n'a pas de forme propre ni de volume...) dans une substance quasi-liquide. La figure 18 rapporte les images d'une mousse à raser diluée dont la phase liquide est imprégnée de fluorescéine. Ici, s'ajoute le facteur "temps (Le temps est un concept développé par l'être humain pour appréhender le changement dans le monde.)". Les images, répétées à quelques minutes ( Forme première d'un document : Droit : une minute est l'original d'un acte. Cartographie géologique ; la minute de terrain est la carte originale, au crayon, levée sur le terrain. Unités et...) d'intervalle, montrent que les bulles ne sont pas stables. Elles éclatent et fusionnent pour donner un maillage de plus en plus gros.


Figure 18: Mousse à raser, microscopie confocale en fluorescence
Chaque image, prise à des temps croissants, résulte de l'addition de coupes optiques espacées
de 15 µm sur une hauteur (La hauteur a plusieurs significations suivant le domaine abordé.) de 200 µm environ. (a) 3 mn - (b) 15 mn - (c) 25 mn - (d) 45 mn
Extrait de Reed, Howard, Shelton, Journal of Microscopy, 1997
Crédit photo The Royal Microscopical Society
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