La spectrométrie de masse est une technique d'analyse chimique permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse monoisotopique. De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser la structure chimique des molécules en les fragmentant.
Son principe réside dans la séparation en phase (Le mot phase peut avoir plusieurs significations, il employé dans plusieurs domaines et...) gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). La spectrométrie de masse (La spectrométrie de masse (mass spectrometry ou MS) est une technique physique d'analyse...) est utilisée dans pratiquement tous les domaines scientifiques : physique (La physique (du grec φυσις, la nature) est étymologiquement la...), astrophysique (L’astrophysique (du grec astro = astre et physiqui = physique) est une branche...), chimie (La chimie est une science de la nature divisée en plusieurs spécialités, à...) en phase gazeuse, chimie organique (La chimie organique est une branche de la chimie concernant l'étude scientifique de...), dosages, biologie (La biologie, appelée couramment la « bio », est la science du vivant....), médecine (La médecine (du latin medicus, « qui guérit ») est la science et la...)...
Le spectromètre de masse, initialement conçu par le britannique Joseph John Thomson (Sir Joseph John Thomson (18 décembre 1856 - 30 août 1940) était...), comporte une source d'ionisation suivie d'un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z, d'un détecteur (Un détecteur est un dispositif technique (instrument, substance, matière) qui change...) qui compte les ions et amplifie le signal ( Termes généraux Un signal est un message simplifié et généralement codé. Il existe...), et enfin d'un système informatique (L´informatique - contraction d´information et automatique - est le domaine...) pour traiter le signal. Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés selon l'axe des abscisses et l'abondance relative de ces ions selon l'axe de ordonnées.
Le spectromètre de masse se compose donc de quatre parties :
Ces analyseurs peuvent être couplés entre eux pour réaliser des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). En général, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision (Une collision est un choc direct entre deux objets. Un tel impact transmet une partie de...) permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.
Les ionisations EI et CI, qui nécessitent un certain niveau de vide (Le vide est ordinairement défini comme l'absence de matière dans une zone spatiale.), sont préférentiellement utilisées en couplage avec la chromatographie en phase gazeuse (la CI fonctionnant à partir d'une source EI). En revanche, les deux sources à pression atmosphérique (électrospray et APCI) dites à "ionisation douce", sont principalement utilisées en couplage avec la chromatographie en phase liquide.
Des électrons émis par un filament rencontrent les molécules qui entrent dans la source : lors de la rencontre, si l'énergie cinétique (L'énergie cinétique (aussi appelée dans les anciens écrits vis viva, ou force vive) est...) des électrons est suffisante, un électron (L'électron est une particule élémentaire de la famille des leptons, et possèdant une charge...) est arraché de la molécule M, la transformant en un ion radical M+°. Celui-ci peut ensuite se fragmenter suivant son énergie (Dans le sens commun l'énergie désigne tout ce qui permet d'effectuer un travail, fabriquer de la...) interne (En France, ce nom désigne un médecin, un pharmacien ou un chirurgien-dentiste, à la...). L'EI conduit ainsi à un spectre assez fourni (Les Foúrnoi Korséon (Grec: Φούρνοι...), avec de nombreux fragments, très riche en informations structurales.
En plus du dispositif EI ci-dessus, un gaz (Un gaz est un ensemble d'atomes ou de molécules très faiblement liés et...) réactif est introduit dans la source et ionisé par impact électronique. S'ensuit une série de réactions qui donne naissance à des ions pouvant réagir avec les molécules d'analyte arrivant dans la source. Ce type de réactions ions-molécules produit principalement (en mode positif) des ions [MH]+ et [M+adduit+H]+, permettant ainsi d'accéder à la masse moléculaire de l'analyte.
Le méthane, l'isobutane (L'isobutane ou 2-méthylpropane est un hydrocarbure de formule brute C4H10 que l'on trouve sous...) et l'ammoniac (L’ammoniac est un composé chimique, de formule NH3 (groupe générique des...) sont parmi les gaz d'ionisation chimique les plus utilisés.
Son principe est le suivant : les gouttelettes de solutés sont formées à l'extrémité d'un fin capillaire de silice (La silice est constituée de dioxyde de silicium, un composé chimique qui entre dans la...), métallisé en surface et porté à un potentiel élevé. Le champ électrique (En physique, on désigne par champ électrique un champ créé par des particules...) intense leur confère une densité de charge (La densité de charge électrique désigne la quantité de charge électrique...) importante. Sous l'effet de ce champ (Un champ correspond à une notion d'espace défini:) et grâce à l'assistance éventuelle d'un courant d'azote (L'azote est un élément chimique de la famille des pnictogènes, de symbole N et de...) co-axial, l'effluent liquide est transformé en nuage (Un nuage est une grande quantité de gouttelettes d’eau (ou de cristaux de glace) en...) de fines gouttelettes (spray) chargées suivant le mode d'ionisation. Sous l'effet d'un second courant d'azote chauffé, les gouttelettes s'évaporent progressivement en perdant des molécules de solvant (Un solvant (également nommé en suisse romande thinner pour les solvants puissant) est un...) par des mécanismes complexes de désolvatation et d'évaporation (L'évaporation est un passage progressif de l'état liquide à l'état gazeux. Elle est différente...). Leur densité (La densité ou densité relative d'un corps est le rapport de sa masse volumique à la...) de charge (La charge utile (payload en anglais ; la charge payante) représente ce qui est effectivement...) devenant trop importante, les répulsions électriques atteignant le niveau des tensions superficielles, les gouttelettes explosent en libérant des microgouttelettes constituées de molécules protonées ou cationisées de l'analyte, porteuses d'un nombre de charges variable (En mathématiques et en logique, une variable est représentée par un symbole. Elle...).
Les ions ainsi formés sont ensuite guidés à l'aide de potentiels électriques appliqués sur deux cônes d'échantillonnage successifs. Durant ce parcours à pression élevée, les ions subissent de multiples collisions avec les molécules de gaz et de solvant, ce qui complète leur désolvatation. En modulant le premier potentiel de cône, il est possible de faire varier l'énergie des collisions et provoquer ainsi une fragmentation plus ou moins importante des ions dans la source.
L'avantage de cette méthode d'ionisation comme pour l'APCI est l'obtention d'ions multichargés, pour les macromolécules, polymères, etc...
Les échantillons liquides sont directement introduits dans un nébuliseur pneumatique. Sous l'effet d'un jet d'air (L'air est le mélange de gaz constituant l'atmosphère de la Terre. Il est inodore et...) ou d'azote, le liquide est transformé en fin brouillard (Le brouillard est le phénomène météorologique constitué d’un amas...). Un chauffage (Le chauffage est l'action de transmettre de l'énergie thermique à un objet, un...) assure ensuite la désolvatation des composés. Ces derniers sont ensuite ionisés chimiquement à pression atmosphérique : en général, la phase mobile vaporisée joue (La joue est la partie du visage qui recouvre la cavité buccale, fermée par les...) le rôle de gaz d'ionisation et les électrons sont obtenus à partir de décharges d'électrode couronne. L'ionisation des composés est très favorisée lors de ces techniques car la fréquence (En physique, la fréquence désigne en général la mesure du nombre de fois qu'un...) des collisions est élevée à pression atmosphérique.
L'APCI est une technique analogue à l'ionisation chimique (CI), elle fait appel à des réactions ions-molécules en phase gazeuse, mais à pression atmosphérique et conduit essentiellement à la formation d'ions [MH]+ ou [M-H]-.
Un faisceau laser pulsé est utilisé, généralement dans le domaine des ultraviolets, pour désorber et ioniser un mélange (Un mélange est une association de deux ou plusieurs substances solides, liquides ou gazeuses...) matrice/échantillon cocristallisé sur une surface métallique, la cible.
Les molécules de matrice absorbent l'énergie transmise par le laser sous forme de photons UV, s'excitent et s'ionisent. L'énergie absorbée par la matrice provoque sa dissociation et son passage en phase gazeuse. Les molécules de matrice ionisées transfèrent leur charge à l'échantillon (De manière générale, un échantillon est une petite quantité d'une matière, d'information, ou...). L'expansion de la matrice entraîne l'échantillon au sein de la phase gazeuse dense où il va finir de s'ioniser.
L'ionisation de l'échantillon a donc lieu soit dans la phase solide avant la désorption, soit par transfert de charge lors de collisions avec la matrice excitée après désorption. Elle conduit à la formation d'ions monochargés et multichargés de type [M+nH]n+, avec une nette (Le terme Nette est un nom vernaculaire attribué en français à plusieurs espèces...) prépondérance pour les monochargés.
C'est une petite molécule, capable de former des cristaux contenant l'analyte. Elle a pour propriété de fortement absorber à la longueur (La longueur d’un objet est la distance entre ses deux extrémités les plus...) d'onde (Une onde est la propagation d'une perturbation produisant sur son passage une variation...) du laser. Elle assure ainsi la stabilité de l'échantillon, le préservant d'une dégradation trop importante par les photons.
Un quadripôle est constitué de quatre électrodes parallèles de section hyperbolique ou cylindrique. Les électrodes opposées distantes de 2r0 sont reliées entre elles et soumises au même potentiel.
Les électrodes adjacentes sont portées à des potentiels de même valeur, mais opposés de sorte que l'écart de potentiel soit égal à φ0.
Ce potentiel φ0 résulte de la combinaison (Une combinaison peut être :) de tensions, l'une continue (U) l'autre alternative (V) de haute fréquence f :
En appliquant cette différence de potentiel entre chaque paire d'électrodes, il se crée un champ électrique quadripolaire. Un point (Graphie) de coordonnées (x,y,z) situé dans le champ électrique sera alors soumis au potentiel :
La trajectoire (La trajectoire est la ligne décrite par n'importe quel point d'un objet en mouvement, et...) d'un ion pénétrant dans le quadripôle sera donc uniforme selon l'axe z et décrite par les équations de Mathieu selon les deux autres axes. Il est possible de définir en fonction des valeurs U et V des zones de stabilité telles que les coordonnées x et y de l'ion restent strictement inférieures à r0. L'une d'entre elles est exploitée en spectrométrie de masse (voir figure) (Les ions qui se trouvent dans cette zone auront donc une trajectoire stable dans le quadripole et seront détectés). En gardant constant le rapport U/V, on obtient une droite de fonctionnement de l'analyseur. Un balayage de U avec U/V constant permet l'observation (L’observation est l’action de suivi attentif des phénomènes, sans volonté de les...) successive de tous les ions dont la zone de stabilité est coupée par la droite de fonctionnement. La résolution entre ces ions est d'autant plus grande que la pente de la droite est élevée.
En l'absence de tension (La tension est une force d'extension.) continue, tous les ions de rapports m/z supérieurs à celui fixé par la valeur de V appliquée auront une trajectoire stable (x et y < r0), le quadripôle est alors dit transparent et sert de focalisateur d'ions.
Les principaux avantages du spectromètre quadripolaire résident dans sa souplesse d'utilisation, sa résolution unitaire sur toute sa gamme de masse, sa vitesse (On distingue :) de balayage satisfaisante, ainsi que son adaptabilité à différentes interfaces permettant le couplage avec la chromatographie gazeuse ou liquide.
C'est un piège ionique où la préparation, l'analyse et la détection des ions s'effectuent dans un même espace, suivant des séquences temporelles successives.
Le piège est constitué de trois électrodes à section hyperbolique : une électrode annulaire encadrée par deux électrodes (d'entrée et de sortie) qui forment les calottes supérieure et inférieure du dispositif. Une tension en radiofréquence combinée ou non à une tension continue U est appliquée entre l'électrode centrale et les deux électrodes calottes. Le champ résultant est alors tridimensionnel.
Les domaines de stabilité des ions sont à nouveau déterminés par les équations de Mathieu. Celui exploité est défini tel que lorsque les ions en sortent, leur trajectoire radiale reste stable contrairement à celle selon l'axe des z. Un balayage de l'amplitude de la radiofréquence V entraînera donc l'expulsion des ions piégés selon cet axe, vers le détecteur. Les trajectoires stables des ions, au sein du champ quadripolaire résultant sont tridimensionnelles, en forme de huit.
L'analyseur à temps de vol consiste à mesurer le temps que met un ion, soumis à une tension préalable, à parcourir une distance donnée (Dans les technologies de l'information, une donnée est une description élémentaire,...).
En effet, l'énergie cinétique (Le mot cinétique fait référence à la vitesse.) vaut :
m étant la masse, v la vitesse, l la distance parcourue pendant le vol, et t le temps de vol.
Par ailleurs, un ion de charge z soumis à une tension accélératrice V gagne une énergie cinétique
e étant la charge élémentaire (La charge élémentaire est, en physique, la charge électrique d'un proton ou, de façon...).
On en déduit ainsi
Le rapport masse sur charge est directement mesurable à partir du temps de vol.
Un analyseur à temps de vol se compose d'une zone d'accélération (L'accélération désigne couramment une augmentation de la vitesse ; en physique,...) où est appliquée la tension accélératrice, et d'une zone appelée tube de vol, libre de champ.
Les ions accélérés pénètrent dans le tube de vol libre (Le vol libre est l'activité sportive ou de loisir consistant à voler avec un planeur ultra léger...) de tout (Le tout compris comme ensemble de ce qui existe est souvent interprété comme le monde ou...) champ. La séparation des ions ne va donc dépendre que de la vitesse acquise lors de la phase d'accélération. Les ions de rapport m/z le plus petit parviendront au détecteur les premiers. Pour chaque groupe d'ions de même rapport m/z, un signal est enregistré au niveau du détecteur sous la forme d'une fonction temps/intensité.
Ce mode de détection comporte cependant certaines limitations en terme de résolution : ainsi deux ions identiques, de même vitesse initiale, mais localisés à deux points différents, entreront dans le tube de vol à des vitesses et des temps différents. Celui le plus loin du détecteur à l'origine sera accéléré plus longtemps et aura donc un temps de vol plus court, d'où une dispersion (La dispersion, en mécanique ondulatoire, est le phénomène affectant une onde dans un...) en temps et en énergie. Le mode réflectron permet de pallier ce phénomène.
En mode réflectron, un miroir (Un miroir est un objet possédant une surface suffisamment polie pour qu'une image s'y forme...) électrostatique (L'électrostatique traite des charges électriques immobiles et des forces qu'elles exercent entre...) impose un champ électrique de direction opposée à celle du champ accélérateur initial, et donc du mouvement des ions. Ces derniers voient ainsi leur trajectoire modifiée : ils pénètrent dans le réflectron et en ressortent avec une vitesse longitudinale de sens (SENS (Strategies for Engineered Negligible Senescence) est un projet scientifique qui a pour but...) opposé ( En mathématique, l'opposé d’un nombre est le nombre tel que, lorsqu’il est à...) à leur vitesse initiale. Les ions les plus énergétiques arrivent les premiers au niveau du réflectron et vont y pénétrer plus profondément, ils seront donc réfléchis dans un temps plus long. De cette façon, tous les ions de même rapport m/z se trouvent focalisés sur un même plan, le détecteur du réflectron étant placé sur le plan de focalisation de ces ions.
En outre, le réflectron permet d'allonger la distance de vol sans pour autant augmenter la taille de l'analyseur : les ions mettent plus de temps pour atteindre le détecteur, et réduisent aussi leur dispersion en temps, la résolution s'en trouve donc grandement améliorée.
L’analyseur à résonance cyclotronique d’ion se compose d’une cellule ICR (de configuration cubique par exemple) qui comporte notamment six plaques sous tension, isolées les unes des autres. L’application d’un champ magnétostatique (La magnétostatique est l’étude du magnétisme dans les situations où le...) B suivant l’axe z soumet les ions à la force de Lorentz (La force de Lorentz, ou force électromagnétique, est la principale manifestation de...) F = ez v ^ B. Leur mouvement dans le plan (xy) est alors " cyclotronique ", c’est-à-dire circulaire uniforme de fréquence f= eB/(2π.m/z). Les ions sont par ailleurs confinés suivant l’axe z par un champ électrostatique imposé par les deux plaques parallèles au plan (Oxy), résultant de l’application d’une tension faible.
Cet analyseur a l’une des meilleures résolutions qui soient (Rs>100 000), dès lors le spectre MS a une plus grande capacité de pics, ce qui maximise la quantité d’informations pour l’analyse de mélanges complexes. Cependant, la largeur (La largeur d’un objet représente sa dimension perpendiculaire à sa longueur, soit...) des pics étant proportionnelle à (m/z)², la résolution est meilleure aux m/z inférieures à 5000 Th. L’excellente précision du FT-ICR sur la mesure de masse (5-10 ppm) lève ou diminue les ambiguïtés sur l’identification des composés. La gamme de masse dépend de la valeur du champ magnétique (En physique, le champ magnétique (ou induction magnétique, ou densité de flux...), elle s’étend jusque 27000 Da pour un champ de 7 T. En revanche, la gamme dynamique (Le mot dynamique est souvent employé désigner ou qualifier ce qui est relatif au mouvement. Il...) est assez restreinte, avec 2-3 décades, car cet analyseur par confinement souffre du même défaut que le piège quadripolaire, la coexistence possible d’un nombre limité d’ions. Dès lors, les pics très minoritaires dans le spectre de masse présenteront une mesure de masse moins précise. Le FT-ICR permet l’analyse en MS/MS dans la cellule même, avec possibilités variées d’activation des ions et donc de fragmentation sélectives.
L’orbitrappe se compose d’une électrode creuse, à l’intérieur de laquelle est placée coaxialement une électrode en forme de fuseau. La forme particulière de ces deux électrodes permet l’imposition d’un champ électrostatique quadro-logarithmique avec la tension : U (r,z) = k/2 (z²-r²/2) + k/2 Rm² ln (r/Rm) +C.
avec Rm rayon caractéristique de l’électrode centrale, k courbure du champ, et C une constante.
Le champ est en particulier quadripolaire suivant l’axe z des électrodes. Les ions sont injectés tangentiellement à l’électrode centrale et piégés autour d’elle par la force (Le mot force peut désigner un pouvoir mécanique sur les choses, et aussi, métaphoriquement, un...) électrostatique qui compense les forces centrifuges. Le mouvement des ions se décompose alors ainsi : un mouvement circulaire autour de l’électrode centrale dans le plan (xy) et un mouvement oscillatoire de va-et-vient selon l’axe z. En particulier, les ions d’un m/z donné seront sur la même trajectoire circulaire qui oscille axialement avec une fréquence f. f est indépendante de la vitesse ou de l’énergie des ions et s’exprime comme 1/2π√(km/z). De la même façon que pour le FT-ICR, le courant induit par ces oscillations permet par une transformée de Fourier d’accéder aux m/z.
La précision des mesures de m/z est particulièrement bonne (1-2 ppm) et la résolution (jusque 100 000) rivalise avec celle du FT-ICR, d’autant qu’étant proportionnelle à 1/√(m/z), elle diminue moins vite avec le m/z que dans le cas du FT-ICR. La gamme dynamique est satisfaisante (> 3 décades). L’orbitrappe est principalement utilisée en spectrométrie de masse en tandem, associée à un piège linéaire
L'ion est éjecté dans un milieu dans lequel règne un champ magnétique uniforme perpendiculaire (En géométrie plane, on dit que deux droites sont perpendiculaires quand elles se coupent en...) au plan de la trajectoire. Du fait de la force de Lorentz, la trajectoire se courbe (En géométrie, le mot courbe, ou ligne courbe désigne certains sous-ensembles du...), et le point d'impact de l'ion (donc sa déviation) permet de connaître sa masse à partir de la charge.
En effet, soit le champ magnétique (dirigeant ) de coordonnées et la vitesse initiale orthogonale à , elle dirige .
On a alors: .
D'où, en écrivant la relation fondamentale (En musique, le mot fondamentale peut renvoyer à plusieurs sens.) de la dynamique : .
Soit: où .
Posons .
On a alors .
En résolvant, .
Et donc: (à l'aide des conditions initiales).
Il s'agit bien de l'équation (En mathématiques, une équation est une égalité qui lie différentes quantités, généralement...) paramétrique d'un cercle (Un cercle est une courbe plane fermée constituée des points situés à égale...) de rayon .
Le spectromètre mesure ensuite les distances d'impact lorsque la particule a effectué un demi-cercle. La distance au point d'origine correspond au diamètre (Dans un cercle ou une sphère, le diamètre est un segment de droite passant par le centre...) donc au double du rayon donné par la dernière formule. La charge de la particule permet donc d'en déduire sa masse.
La spectrométrie de masse en tandem consiste à sélectionner un ion par une première spectrométrie de masse, à le fragmenter, puis à effectuer une deuxième spectrométrie de masse sur les fragments ainsi générés.
Elle peut être réalisée à l'aide de nombreux appareils combinant des secteurs magnétiques, électriques, quadripolaires ou des temps de vol, mais également au sein d'un même analyseur dans le cas d'une trappe d'ions.
Un triple quadripôle résulte de l'association de deux analyseurs quadripolaires en série, séparés par une cellule de collision souvent constituée d'un quadripôle plus court. Cette combinaison de quadripôles permet de travailler en MS simple ou en tandem. Pour réaliser une acquisition (En général l'acquisition est l'action qui consiste à obtenir une information ou à acquérir un...) en MS, il suffit de n'appliquer qu'une tension alternative à l'un des analyseurs pour le rendre "transparent" comme la cellule de collision, celle-ci ne contenant alors pas de gaz.
Lors d'une acquisition en MS/MS, la cellule de collision est remplie d'un gaz inerte (argon par exemple) sous une pression relativement élevée (10 − 2 torr). L'énergie cinétique de l'ion sélectionné est convertie lors de ses collisions successives en énergie interne. La dissociation de l'ion se réalisera lorsque son énergie interne sera devenue supérieure à l'énergie d'activation (Activation peut faire référence à :) nécessaire à la fragmentation. Cette technique de dissociation activée par collision (CAD) peut être amplifiée en augmentant l'énergie cinétique des ions sélectionnées par application d'une différence de potentiel entre la source et la cellule de collision.
L'analyse MS/MS peut être menée selon quatre modes différents selon l'information recherchée : le mode descendant est le plus utilisé pour obtenir des informations structurales, les deux modes (ascendant et perte de neutre) sont d'un usage plus restreint et permettent de mettre en évidence des ions ayant des particularités communes. Le quatrième mode (Multiple Reaction Monitoring ou MRM), dérivé du mode descendant, est voué à la quantification.
Au sein d'un piège quadripolaire ("trappe d'ions"), l'analyse en tandem se réalise dans un premier temps par sélection d'ions dont la valeur m/z est choisie. Ces ions piégés vont ensuite se fragmenter par collision (acquisition d'énergie interne, excitation vibrationnelle) à l'aide d'une tension RF (radiofréquence) correspondant à leur fréquence de résonance, et les ions produits formés sont à leur tour piégés. Une éjection sélective en masse des ions produits (fragments) peut alors être réalisée en vue (La vue est le sens qui permet d'observer et d'analyser l'environnement par la réception et...) de leur analyse.
L'obtention d'ions de générations supérieures est possible par simple renouvellement du processus (sélection d'un ion produit, fragmentation, sélection d'un ion produit de 2e génération, fragmentation, etc...). Cette séquence est appelée MSn, n étant le nombre de générations d'ions. Ainsi la MS2 est la MS-MS et ainsi de suite...
Ces appareils permettent de combiner les points forts des analyseurs quadripôles et des Tofs. Il sont constitués d'un double quadripôle (1er analyseur et cellule de collision) et d'un analyseur à temps de vol comme second analyseur. Les avantages par rapport à un triple quad sont une meilleure sensibilité et une meilleure résolution.