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Coloration de Gram

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mis au point le protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.

  • Réalisation du frottis :

Elle nécessite d'avoir un frottis (En médecine, on appelle frottis un prélèvement médical au moyen d'un écouvillon stérile, d'une petite brosse ou d'une petite spatule :) fixé, soit

  1. par l'alcool durant 5 minutes (et rinçage à l'eau),
  2. plus classiquement en effectuant une fixation simple à l'eau (L’eau est un composé chimique ubiquitaire sur la Terre, essentiel pour tous les organismes vivants connus.) et à la flamme selon les indications suivantes : sur une lame, déposer une goutte d'eau stérile. Ajouter à l'anse de platine (Le platine est un élément chimique de symbole Pt et de numéro atomique 78.) stérilisée une goutte de la colonie isolée. Étaler et fixer à la chaleur (Dans le langage courant, les mots chaleur et température ont souvent un sens équivalent : Quelle chaleur !) à environ 40°C pendant 10 à 15 minutes. Poser la lame séchée sur le portoir reposant sur un bac de coloration.
Des bactéries à Gram - (Escherichia coli)
Des bactéries à Gram - (Escherichia coli)
  • Réalisation de la coloration :

Voici succinctement les différentes étapes de cette coloration :

  1. Coloration par le violet (Le violet est une couleur, composée d'un mélange de bleu (environ 50% de luminosité) et de rouge (environ 25% de luminosité) en synthèse additive, et d'un mélange de magenta (environ 100%) et de...) de gentiane ou cristal (Cristal est un terme usuel pour désigner un solide aux formes régulières, bien que cet usage diffère quelque peu de la définition scientifique de ce...) violet. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute ( Forme première d'un document : Droit : une minute est l'original d'un acte. Cartographie géologique ; la minute de terrain est la carte...). Rincer à l'eau déminéralisée.
  2. Mordançage au lugol (solution d'iode (L'iode est un élément chimique de la famille des halogènes, de symbole I et de numéro atomique 53.) iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus de sécurité.
  3. Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange (Un mélange est une association de deux ou plusieurs substances solides, liquides ou gazeuses qui n'interagissent pas chimiquement. Le résultat de l'opération est une préparation aussi...) alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée;
  4. Recoloration à la safranine ou à la fuschine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute ( Forme première d'un document : Droit : une minute est l'original d'un acte. Cartographie géologique ; la minute de terrain est la...). Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.
  5. Observer avec une goutte d'huile (L'huile est un terme générique désignant des matières grasses qui sont à l'état liquide à température ambiante et qui ne se...) à immersion objectif 100 (grossissement x1000).

Les étapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de la bactérie (Les bactéries (Bacteria) sont des organismes vivants unicellulaires procaryotes, caractérisées par une absence de noyau et d'organites. La plupart des bactéries possèdent une paroi cellulaire glucidique, le...). Le violet de gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne (En France, ce nom désigne un médecin, un pharmacien ou un chirurgien-dentiste, à la fois en activité et en formation à l'hôpital ou en...).

L'étape 3 (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites " Gram négatives ". En effet, celles ci ont une paroi riche en lipides (phospholipides, LPS) qui va laisser passer (Le genre Passer a été créé par le zoologiste français Mathurin Jacques Brisson (1723-1806) en 1760.) l'alcool (molécule lipophile) ou le mélange alcool-acétone, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites " Gram positif " la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car trop épaisse et gluco-protéique. Elles resteront alors violettes.

L'étape 4 est une contre-coloration ayant pour but de redonner aux bactéries Gram négatives précédemment décolorées une teinte rose permettant de les visualiser au microscope. Les bactéries à Gram positif (Les bactéries à gram positif sont mises en évidence par une technique de coloration appelée coloration de Gram. Les bactéries à gram positif apparaissent alors mauves au microscope. La...) restées violettes seront évidemment insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur cytoplasme.

Des bactéries à Gram + : Bacillus subtillis
Des bactéries à Gram + : Bacillus subtillis

Ces différences de coloration et les différences de formes (bacille ou cocci) sont à l'origine de la classification des bactéries.

Nota: Certains germes restent insensibles à cette coloration, c'est le cas, entre autre, des mycobactéries (famille à laquelle appartiennent les agents de la tuberculose (La tuberculose est une maladie infectieuse transmissible et non immunisante, avec des signes cliniques variables. Elle est provoquée par une mycobactérie du complexe tuberculosis correspondant à différents...) et de la lèpre).

Source: Wikipédia publiée sous licence CC-BY-SA 3.0.

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