Jusqu'à la Seconde Guerre mondiale, Pauling n'a pas d'engagement politique. Au cours de la guerre, il contribue à la mise au point d'explosifs et de carburant pour missiles. Il met également au point un détecteur de niveau d'oxygène pour les sous-marins. Au commencement du Projet Manhattan, Robert Oppenheimer lui propose de prendre la tête du département de chimie du projet, proposition qu'il refuse. Suite à ces contributions à l'effort de guerre américain, il recevra la médaille présidentielle du mérite en 1948 des mains de Harry Truman. Cependant, les bombardements de Hiroshima et Nagasaki le marquent profondément. En 1946, il rejoint le Comité d'urgence des scientifiques atomistes, dirigé par Albert Einstein, et dont le but est d'avertir l'opinion publique des dangers associés au développement des armes nucléaires. Son activisme politique conduit le Département d'état américain à lui refuser un passeport en 1952 lorsqu'il est invité à un congrès scientifique à Londres. Son passeport lui est rendu en 1954, peu avant la cérémonie lui attribuant son prix Nobel de chimie à Stockholm. En 1955, il signe le manifeste Russell-Einstein, en compagnie d'Einstein, de Bertrand Russell et de huit autres scientifiques et intellectuels de premier plan.
En 1957, Pauling lance une pétition en collaboration avec le biologiste Barry Commoner, qui a étudié la présence de strontium-90 radioactif dans les dents de lait des enfants et conclut que les essais nucléaires dans l'atmosphère présentent des risques pour la santé publique du fait des retombées radioactives. Il participe également à un débat public avec le physicien atomiste Edward Teller au sujet des risques réels de mutations causées par les retombées. En 1958, Pauling et sa femme présentent aux Nations unies une pétition signée par plus de 11 000 scientifiques et appelant à l'arrêt des essais nucléaires. La pression de l'opinion publique conduit à un moratoire sur les essais en surface, suivi par la signature du traité d'interdiction partielle des essais nucléaires par John Fitzgerald Kennedy et Nikita Khrouchtchev. En 1963, le jour de l'entrée en vigueur du traité, le comité Nobel décerne à Pauling le prix Nobel de la paix pour 1962 (mis en réserve jusque-là), le décrivant comme « Linus Pauling, qui depuis 1946 a fait sans cesse campagne, non seulement contre les essais nucléaires, non seulement contre la prolifération des armes nucléaires, non seulement contre leur utilisation, mais contre l'usage des guerres comme moyen de résoudre des conflits internationaux. » Le département de chimie du Caltech, circonspect devant ses engagements politiques, ne le félicite pas officiellement. En revanche, le département de biologie lui offre une petite réception, montrant ainsi sa sympathie pour son travail sur les mutations induites par les radiations. En 1964, il doit quitter son poste au Caltech sous la pression du conseil d'administration qui désapprouve ses engagements politiques. Il travaille alors successivement à San Diego de 1967 à 1969 et à l'université Stanford de 1969 à 1973.
Beaucoup des détracteurs de Pauling, parmi lesquels des scientifiques appréciant ses travaux de chimie, sont en désaccord avec ses positions politiques et se le représentent comme un porte-parole naïf du communisme soviétique. En 1955, il est cité à comparaître devant le Sous-comité pour la sécurité intérieure du Sénat, qui le décrit comme « la personnalité scientifique numéro un dans toutes les activités importantes de l'offensive pacifiste communiste dans le pays » . Il sera convoqué plusieurs fois devant cette commission, notamment après la pétition contre les essais nucléaires. Le magazine Life décrit en une son prix Nobel de la paix comme « A Weird Insult from Norway » (une étrange insulte de la part de la Norvège). En 1970, Pauling est lauréat du Prix Lénine pour la paix décerné par l'URSS.
Jusqu'à la fin de sa vie, il se sert de sa notoriété pour s'élever contre les conflits armés, depuis des protestations contre la guerre du Viêt Nam, jusqu'à un « appel pour la paix en Croatie » en 1991. Il est également un critique féroce de l'interventionnisme américain en Amérique latine, notamment au Nicaragua.