Comment visualiser les molécules d'ARN in vivo

Publié par Adrien le 29/10/2020 à 09:00
Source: CNRS INSB
Les scientifiques ont développé une nouvelle méthode pour observer les molécules d'ARN messager dans les cellules végétales. Publié dans la revue Plant Journal, cette méthode utilise BglG, une protéine anti-terminateur bactérienne qui se lie à un motif de structure tige-boucle spécifique dans l'ARN cible. Le système BglG peut être largement applicable pour étudier le transport (Le transport est le fait de porter quelque chose, ou quelqu'un, d'un lieu à un autre, le plus souvent en utilisant des véhicules et des voies de communications (la route, le canal ..)....) et la localisation de l'ARNm dans les plantes.

Le transport et la localisation des ARN messager (ARNm) après leur synthèse sont des mécanismes importants pour déterminer la localisation subcellulaire de la traduction des protéines. En dictant la localisation spécifique où les protéines sont traduites et fonctionnent, les processus de localisation de l'ARN jouent un rôle central dans la détermination de la polarité cellulaire, la structuration embryonnaire, les décisions asymétriques sur le devenir des cellules, la morphogenèse neuronale, la migration cellulaire ou la polarité épithéliale.


Figure: Détection de MP:GFP ARNm en utilisant le système BglG. Microscopie confocale à fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur. (on parle parfois de « lumière froide »). Elle peut servir à caractériser un matériau.) d'une cellule épidermique de N. benthamiana exprimant MP:GFP à partir d'ARNm marqué avec des boucles de tige (La tige est chez les plantes à fleurs, l'axe, généralement aérien, qui prolonge la racine et porte les bourgeons et les feuilles. La tige se ramifie généralement en...) de liaison BglG (MP:GFP-SL, canal vert (Le vert est une couleur complémentaire correspondant à la lumière qui a une longueur d'onde comprise entre 490 et 570 nm. L'œil humain possède un...), à gauche) avec la protéine (Une protéine est une macromolécule biologique composée par une ou plusieurs chaîne(s) d'acides aminés liés entre eux par...) BglG:mRFP (canal rouge (La couleur rouge répond à différentes définitions, selon le système chromatique dont on fait usage.), milieu ). L'image fusionnée à droite montre la co-localisation de MP:GFP et BglG:mRFP (signal jaune (Il existe (au minimum) cinq définitions du jaune qui désignent à peu près la même couleur :), à droite), démontrant ainsi que les particules MP:GFP représentent des granules d'ARN avec l'ARNm MP:GFP.
© Eduardo José Peña

Il est admis que les ARNm sont transportés sous forme de complexes de ribonucléoprotéines (RNP) ou de "granules d'ARN". Ces granules sont transportés par des moteurs (Un moteur est un dispositif transformant une énergie non-mécanique (éolienne, chimique, électrique, thermique par exemple) en une énergie mécanique ou...) moléculaires le long du cytosquelette jusqu'à leur destination finale, où les ARNm sont ancrés et finalement traduits. L'analyse des mécanismes de transport d'ARN chez les plantes repose sur des méthodes d'imagerie (L’imagerie consiste d'abord en la fabrication et le commerce des images physiques qui représentent des êtres ou des choses. La fabrication se faisait jadis soit à la main, soit par...) efficaces pour suivre les molécules d'ARN transportées in vivo.

Dans le cadre d'une collaboration avec l'Université (Une université est un établissement d'enseignement supérieur dont l'objectif est la production du savoir (recherche), sa conservation et sa transmission (études...) de La Plata (Argentine), les scientifiques ont développé une nouvelle méthode pour observer la dynamique (Le mot dynamique est souvent employé désigner ou qualifier ce qui est relatif au mouvement. Il peut être employé comme :) des mouvements et localisations de molécules d'ARN messager dans les cellules végétales. Cette méthode utilise BglG, une protéine bactérienne anti-terminateur de la transcription qui se lie à un motif de structure tige-boucle spécifique dans l'ARN cible. Ainsi, les molécules d'ARN marquées avec ce motif tige-boucle peuvent être visualisées en présence de BglG fusionnée avec un marqueur fluorescent.

Les chercheurs ont utilisé un ARNm codant pour la protéine de mouvement (MP) du virus (Un virus est une entité biologique qui nécessite une cellule hôte, dont il utilise les constituants pour se multiplier. Les virus existent sous une forme extracellulaire ou intracellulaire. Sous la...) de la mosaïque du tabac (VMT) comme modèle. La MP est une protéine de liaison à l'ARN qui est nécessaire à la propagation du virus de cellule à cellule. Pour remplir cette fonction, la protéine forme un complexe avec l'ARN viral et utilise des mécanismes de transport cellulaire pour cibler l'ARN viral vers de petits pores de la paroi cellulaire végétale appelés plasmodesmes par lesquels il pénètre dans de nouvelles cellules. Les chercheurs ont utilisé une méthode appelée agroinfiltration pour exprimer la MP fusionnée à la protéine fluorescente verte (MP:GFP) dans des cellules de feuilles de Nicotiana benthamiana. Par microscopie confocale à fluorescence, la protéine est ainsi visualisée sous la forme de petites particules fluorescentes soit stationnaires, soit mobiles, dans la région corticale des cellules épidermiques.

Pour déterminer si ces particules contiennent l'ARNm codant pour MP:GFP, on a ajouté à ce dernier des séquences d'ARN formant (Dans l'intonation, les changements de fréquence fondamentale sont perçus comme des variations de hauteur : plus la fréquence est élevée, plus la hauteur perçue est haute et inversement. Chaque voyelle se caractérise...) des structures tige-boucle spécifiques qui se lient à la protéine BglG. Lorsque cette construction est exprimée avec la protéine BglG fusionnée à la protéine fluorescente rouge (BglG:RFP), les particules MP:GFP (vertes) se révélent associées à BglG (rouge), identifiant (En informatique, on appelle identifiants (également appelé parfois en anglais login) les informations permettant à une personne de s'identifier auprès d'un système.) ainsi les particules sous forme de granules d'ARN. Cette association n'est pas retrouvée lorsque MP:GFP est exprimé à partir d'une construction sans les boucles de tige de liaison BglG.

Les chercheurs ont également montré que l'ARNm colocalise avec MP:GFP dans les plasmodesmes et que BglG:RFP était même transportée dans les cellules adjacentes, reliant ainsi l'observation (L’observation est l’action de suivi attentif des phénomènes, sans volonté de les modifier, à l’aide de moyens d’enquête et d’étude...) des granules d'ARNm avec le transport intercellulaire de l'ARNm.

Des expériences biochimiques confirment que ce complexe MP:ARN:BglG se forme en présence des tige-boucles se liant (Un liant est un produit liquide qui agglomère des particules solides sous forme de poudre. Dans le domaine de la peinture, il permet au pigment d'une...) à BglG.

Enfin, les auteurs ont comparé le système BglG avec d'autres systèmes de marquage d'ARNm. Contrairement aux protéines de liaison à l'ARN utilisées dans d'autres systèmes de marquage d'ARNm (appelées "MS2" et "λN"), la protéine BglG n'a pas tendance à former des agrégats dans les cellules végétales lorsqu'elle est présente en quantité (La quantité est un terme générique de la métrologie (compte, montant) ; un scalaire, vecteur, nombre d’objets ou d’une autre...) élevée, ce qui est très important pour la détection spécifique des granules d'ARN. Le système BglG peut donc être largement applicable pour étudier le transport et la localisation de l'ARNm dans les plantes.

Pour en savoir plus:
In vivo imaging of tagged mRNA in plant tissues using the bacterial transcriptional antiterminator BglG.
Peña EJ, Robles Luna G, and Heinlein M.
The Plant J, 24 Oct 2020 https://doi.org/10.1111/tpj.15035

Laboratoire:
Institut de biologie moléculaire (La biologie moléculaire (parfois abrégée bio mol ou BM) est une discipline scientifique au croisement de la génétique, de la biochimie et de la physique, dont l'objet est la compréhension des...) des plantes (IBMP) - (CNRS)
12, rue (La rue est un espace de circulation dans la ville qui dessert les logements et les lieux d'activité économique. Elle met en relation et structure les différents quartiers, s'inscrivant de ce...) du général Zimmer, 67084 Strasbourg, France.
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