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Des travaux publiés dans la revue Nature Methods par les équipes d'Emmanuel Beaurepaire (Laboratoire d'optique et biosciences (LOB), École Polytechnique, CNRS, Inserm), de Jean Livet (Institut de la Vision, CNRS, UPMC, Inserm) et de Xavier Morin (Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure (ENS), CNRS, INSERM), démontrent une nouvelle stratégie de microscopie biphotonique multicouleurs adaptée à l'observation en profondeur de tissus biologiques intacts marqués avec des chromophores distincts, par exemple des protéines fluorescentes de couleurs différentes.
Cette avancée est une évolution de la microscopie multiphotonique, développée à partir des années 90. Elle a ouvert une nouvelle fenêtre pour l'étude du vivant car elle permet d'observer en trois dimensions un tissu biologique intact à une profondeur dépassant la centaine de micromètres.
Cortex de souris marqué.
Imagerie 3D multiphoton multicouleurs d'un échantillon épais de cortex de souris.
Grâce à la technique de marquage génétique 'Brainbow', chaque cellule produit trois protéines fluorescentes (bleue, jaune et rouge) dans des proportions différentes. La nouvelle stratégie d'imagerie permet d'étudier la connectivité neuronale à des profondeurs de l'ordre du demi?millimètre dans le tissu cérébral intact. Volume imagé: 900*700*370 ?m3.
Adapté de Mahou et al, Nat. Methods 2012.
Cette approche ne permettait pas jusqu'ici d'effectuer efficacement une imagerie "en couleurs", c'est-à-dire d'observer simultanément trois marqueurs différents (par exemple bleu, vert et rouge). C'est ce que la technique développée par les biologistes et physiciens de l'Inserm et du CNRS à l'École Polytechnique permet de faire aujourd'hui.
Dans le domaine de la recherche biomédicale, elle va permettre d'étudier l'architecture et le développement de structures multicellulaires complexes telles que le système nerveux central ou l'embryon en développement, en visualisant simultanément plusieurs paramètres au sein du tissu.
Les chercheurs du LOB ont appliqué cette approche pour visualiser "en couleurs" et en profondeur le développement d'embryons de Drosophile, ainsi que le cerveau ou la moelle épinière de souris et d'embryons de poulet marqués avec la stratégie de marquage transgénique multicouleurs dite 'Brainbow' développée par les équipes de l'Institut de la Vision et de l'ENS. La nouvelle méthode d'imagerie facilite la reconstruction tridimensionnelle et le suivi dynamique des systèmes étudiés. Il devient possible de visualiser à grande échelle l'agencement des cellules neurales et gliales dans le cerveau, le mouvement ou les filiations cellulaires dans l'embryon en développement sur un critère de couleur.
Ce "passage en couleurs" de la microscopie multiphotonique est directement transposable à d'autres problématiques (suivi de cellules en mouvement, imagerie dynamique de la signalisation, etc.) et devrait trouver de nombreuses applications en biologie des systèmes.
Moelle épinière d'embryon de poulet marquée.
Imagerie 3D multiphoton multicouleurs d'un échantillon épais et vivant de moelle épinière d'embryon de poulet. Comme pour les images précédentes, la nouvelle stratégie d'imagerie permet d'étudier le développement du tissu vivant et les relations de filiation entre les cellules sur de grands volumes.
Échelle image: 400?m * 500 ?m.
Adapté de Mahou et al, Nat. Methods 2012
Référence:
“Multicolor two?photon tissue imaging by wavelength mixing” ? P. Mahou, M. Zimmerley, K. Loulier, K. Matho, G. Labroille, X. Morin, W. Supatto, J. Livet, D. Débarre & E. Beaurepaire.
Nature Methods (2012).