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Pour tous les microscopes optiques (y compris les microscopes fluorescents), la plus haute résolution spatiale réalisable est régie par certaines lois physiques fondamentales liées à la propagation de la lumière. Il existe une limite de résolution (appelée limite de diffraction) qui ne peut être dépassée par des moyens physiques (par exemple en modifiant la configuration de l'objectif ou l'ouverture numérique du système optique). Dans les paramètres d'acquisition standard, la limite de diffraction, c'est-à-dire la taille des entités biologiques que nous sommes capables de distinguer, est approximativement égale à 200 nanomètres (10-6 mm) dans le plan latéral (le plan x-y) et à 500 nm dans l'axe axial (la direction z). Comme de nombreuses entités biologiques d'intérêt ont une taille inférieure à ces valeurs, la mise en oeuvre de techniques de super-résolution appropriées peut donc améliorer considérablement la visualisation d'entités subcellulaires et permettre la compréhension des fonctions biologiques qui se produisent au niveau moléculaire.
Récemment, un microscope Multi Angle - TIRF (MA-TIRF) a été prototypé (l'un des trois en France) en collaboration avec l'Institut de Biologie Valrose (iBV - CNRS/Inserm/Université Côte d'Azur). Le microscope est accompagné d'un algorithme de reconstruction dédié qui permet d'atteindre une résolution axiale sans précédent, bien au-delà de la limite de diffraction et encore inégalée par les systèmes commerciaux d'imagerie des cellules vivantes.
Cependant, la résolution latérale de ce système restait limitée par la diffraction. Dans ce travail, les chercheurs ont combiné la reconstruction MA-TIRF avec une technique de super-résolution latérale appelée Covariance-based ℓ0 super-Resolution Microscopy with intensity Estimation (COL0RME) qui exploite le comportement statistique indépendant des émetteurs fluorescents standard.
(a) Une image de la pile temporelle d'images acquises par le microscope.
(b) Images super-résolues sur le plan latéral estimées par la méthode COL0RME.
(c) Le volume 3D estimé par la méthode 3D MA-TIRF COL0RME.
Les chercheurs partent d'une pile temporelle d'images acquises par le microscope sous différents angles, comme celles de la ligne (a) de l'image ci-dessus, puis ils calculent des images super-résolues latéralement, comme celles de la ligne (b), en utilisant la méthode COL0RME, et enfin ils estiment l'image super-résolue 3D présentée dans la ligne (c). Les données réelles montrées dans l'image ci-dessus sont des microtubules de cellules endothéliales aortiques bovines, colorées avec l'Alexa-Fluor 488.
En comparant le volume 3D estimé par la reconstruction MA-TIRF préexistant (partie inférieure droite de l'image ci-dessous) et celui estimé par la méthode 3D MA-TIRF COL0RME proposée (partie supérieure gauche), il est possible d'observer une très bonne amélioration de la résolution latérale tout en conservant la bonne résolution axiale.
Comparaison entre les méthodes MA-TIRF standard et 3D MA-TIRF COL0RME. La couleur quantifie la profondeur de l'échantillon.
Notes:
1 - Vasiliki Stergiopoulou, Luca Calatroni, Henrique de Morais Goulart, Sébastien Schaub, and Laure Blanc-Féraud. “COL0RME: Super-resolution microscopy based on sparse blinking/fluctuating fluorophore localization and intensity estimation." Biological Imaging, vol. 2, e1, 2022.
2 - Doctorante au Laboratoire Informatique, Signaux et Systèmes de Sophia-Antipolis (I3S - CNRS/Université Côte d'Azur)
3 - Chargé de recherche CNRS au Laboratoire Informatique, Signaux et Systèmes de Sophia-Antipolis (I3S - CNRS/Université Côte d'Azur)
4 - Ingénieur de recherche CNRS au Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-mer (LBDV - CNRS/Sorbonne Université)
5 - Directrice de recherche CNRS au Laboratoire Informatique, Signaux et Systèmes de Sophia-Antipolis (I3S - CNRS/Université Côte d'Azur)
Publication:
Vasiliki Stergiopoulou, Luca Calatroni, Sébastien Schaub, and Laure Blanc-Féraud, “3D Image Super-Resolution by fluorophore fluctuations and MA-TIRF microscopy reconstruction (3D-COL0RME).” IEEE 19th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), 2022.
Contacts:
- Vasiliki Stergiopoulou - Doctorante à l'I3S - Vasiliki.STERGIOPOULOU at univ-cotedazur.fr
- Luca Calatroni - Chargé de recherche CNRS à l'I3S - calatroni at i3s.unice.fr
- Sébastien Schaub - Ingénieur de recherche CNRS au LBDV - sebastien.schaub at imev-mer.fr
- Laure Blanc-Féraud - Directrice de recherche CNRS à l'I3S - laure.blanc-feraud at cnrs.fr