Porté à la direction de l’Institut Bayer de pathologie et de bactériologie, il y poursuit, dans le prolongement des travaux de Paul Ehrlich, les recherches de Josef Klarer et Fritz Mietzsch visant à l’utilisation des colorants (qui sont alors les principales substances fabriquées par l’IG Farben) comme antibactériens. Il découvre que l’un d’entre eux, la sulfamidochrysoïdine, est actif contre les streptocoques. Il emploie aussitôt ce médicament, breveté sous le nom de Prontosil, pour traiter sa propre fille qu’il sauve de l’amputation d’un bras. La même année, Leonard Colebrook l'utilise avec succès contre la fièvre puerpérale.
En 1939, Domagk reçoit le prix Nobel pour la découverte du premier médicament efficace contre les infections bactériennes. Mais le régime nazi l’oblige à refuser le prix, et il est incarcéré pendant une semaine par la Gestapo. En effet, après l’attribution en 1935 du prix Nobel à Carl von Ossietzky, opposant au régime, le gouvernement nazi, ulcéré, avait promulgué une loi interdisant à tout ressortissant allemand d’accepter ce prix.
J. et Th. Tréfouël, F. Nitti et D. Bovet, dans le laboratoire d'Ernest Fourneau à l’Institut Pasteur, ayant isolé le p-aminophénylsulfamide, principe actif du Prontosil, les médicaments sulfamidés se révèlent une arme révolutionnaire, surpassant les phagothérapies. Mais ils seront remplacés plus tard par la pénicilline, à la fois plus efficace et mieux tolérée (les sulfamides peuvent en effet provoquer la formation de calculs rénaux ou une altération de la moelle osseuse).
