Son assemblage fut terminé le 10 avril 1984. Atlantis effectua sa mission inaugurale le 3 octobre 1985, un des cinq vols au cours desquels elle a mené des activités militaires secrètes. En 1989, Atlantis déploya deux sondes spatiales, Magellan et Galileo, et en 1991, elle lança le Compton Gamma-Ray Observatory.
À partir de 1995, Atlantis a réalisé sept vols directs vers la station spatiale soviétique Mir. Lors du second vol vers Mir, elle a apporté un module d’arrimage qui a permis des échanges d'astronautes lors des vols suivants.
De novembre 1997 à juillet 1999, Atlantis a été l’objet d’une opération de remise à niveau, avec quelque 165 modifications apportées à la navette, dont l’installation d’une planche de bord tout écran (Multifunction Electronic Display System). Depuis, elle a effectué six vols, qui concernaient tous des activités d’assemblage de la Station spatiale internationale.
En octobre 2002, Atlantis et son équipage de six personnes effectua une mission de onze jours sur la Station spatiale internationale qui nécessita trois sorties extra-véhiculaires.
La NASA avait programmé le 27 lancement d’Atlantis entre le 9 et le 24 septembre 2005. La mission était jugée peu sûre, et la fenêtre de lancement fut ratée, à cause d’incidents pendant le lancement de Discovery lors de la mission STS-114 et la suspension de tout lancement de navette décidée par la NASA. Atlantis était la navette de secours prévue pour la mission STS-114. Atlantis devait être utilisée pour la mission STS-121, mais il fut décidé que ce serait Discovery qui mènerait cette mission.
Atlantis doit être retirée du service en 2008 après son dernier vol prévu, STS-126. Elle devrait être utilisée comme source de pièces détachées pour Discovery et Endeavour jusqu’à la fin anticipée du programme Space Shuttle en 2010. Atlantis a été choisie pour un désarmement précoce afin d’éviter un programme de maintenance coûteux qui devait débuter en 2008.