Cypripedium reginae se reproduit le plus souvent de façon végétative. Cette façon de se reproduire produit des clones possédant exactement le même matériel génétique. Une population de cypripèdes royaux présente donc une très faible variation génétique.
Le cypripède royal, bien qu’il soit le plus grand représentant des orchidées au Québec, possède probablement le plus petit orifice du labelle. Chez le C. acaule, l’orifice est assez grand pour laisser passer les bourdons mais celui de C. reginae semble être trop petit pour laisser passer ces insectes. Son pollinisateur n’est pas encore connu avec exactitude mais, une abeille noire, probablement de la famille des Megachile, a été observée entrant dans son labelle. Cette abeille en est ressortie couverte de pollen. Une autre étude effectuée au Vermont démontre que la pollinisation de cette orchidée y est faite la plupart du temps par une mouche (Syrphus torvus) et par la « flower beetle » (Trichiotinus assimilis). En résumé, l’insecte ou les insectes capables de polliniser le cypripède royal nous sont encore inconnus.
Les graines de ce cypripède ont une pellicule imperméable qui doit être digérée par des bactéries ou des champignons avant de pouvoir germer. Cette caractéristique limite les chances de germination des graines immatures qui pourraient geler par la suite.
Kéry (2004) rapporte des épisodes de dormance pouvant durer entre 1 et 4 ans pour une colonie de C. reginae. Entre 8 et 33% des plants d’une population sont dormants chaque année. Un petit % de plantes en dormance représente une population en santé.
Le cypripède royal pousse très lentement. La germination s’effectue à une profondeur de moins de 5 cm. Après la germination en conditions favorables, il faudra attendre 3 ans avant de voir sortir du sol sa première feuille. Après 7 ans, il ne mesure que 8 cm de haut. Quinze à seize ans après la germination, C.reginae est prêt à fleurir.
Il possède 2n = 20 chromosomes.