Onnes débute ses études universitaires à Groningue. Il étudie ensuite à l'Université d'Heidelberg de 1871 à 1873 notamment sous la direction de Robert Wilhelm Bunsen et Gustav Kirchhoff. Il retourne ensuite à Groningue où il obtient son master en 1878 et son doctorat en 1879 avec une thèse intitulée Nieuwe bewijzen voor de aswenteling der aarde (nouvelles preuves de la rotation de la terre). De 1878 à 1882, il est assistant de Johannes Bosscha, alors directeur de l'école polytechnique de Delft, qu'il remplace en tant que lecteur de 1881 à 1882.
De 1882 à 1923, Onnes est professeur de physique expérimentale à l'Université de Leyde. En 1904, il fonde un grand laboratoire de cryogénie et y attire d'autres chercheurs, ce qui contribue à sa reconnaissance par la communauté scientifique. Il est le premier à réussir à liquéfier de l'hélium le 10 juillet 1908 à l'aide de cryostats, ce qui lui vaut la Médaille Franklin en 1915. En utilisant l'effet Joule-Thomson, il parvient à faire diminuer la température jusqu'à moins de 1 degré au-dessus du zéro absolu et atteint 0,9K. C'est la température la plus froide jamais atteinte à cette époque. Les équipements qui lui permirent cette réalisation sont visibles aujourd'hui au Musée Boerhaave de Leyde. Il étudie ensuite les effets du froid extrême sur un certain nombre de gaz et de métaux, ce qui lui vaut la Médaille Rumford en 1912.