Hérophile est considéré comme l'un des fondateurs de la méthode scientifique. Il a introduit la méthode expérimentale en médecine, car il considérait qu'il était essentiel de fonder les connaissances sur des bases empiriques. Pour cela, il a été critiqué par Galien au motif que la méthode expérimentale contredisait la rationalité.
La médecine conventionnelle de l'époque tournait autour de la Théorie des humeurs, selon laquelle c’était un déséquilibre entre la bile, la bile noire, le flegme et le sang qui provoquait la maladie. On croyait que les veines étaient remplies de sang et d'un mélange d'air et d'eau.
Hérophile fut le premier, avec Érasistrate, à fonder ses conclusions sur la dissection du corps humain. Il prêta une attention particulière au système nerveux ; distinguant les nerfs des vaisseaux sanguins, il semble qu'il fut le premier à distinguer les nerfs moteurs des nerfs sensoriels. Il a décrit le rôle du nerf optique et des nerfs oculomoteurs dans la vue et les mouvement oculaires. Il distingua le cerveau du cervelet, le quatrième ventricule, le calamus scriptorius (qu’il considérait comme le siège de l'âme humaine ) et le torcular, les méninges, le sinus veineux, ainsi que les nerfs rachidiens. Il étudia le cerveau et l'identifia comme le centre du système nerveux et l'emplacement de l'intelligence. Il enseignait que les nerfs sensoriels et moteurs partaient du cerveau et que la transmission nerveuse se faisait par le biais du pneuma . Une partie de sa conception du corps humain impliquait l’existence du pneuma, qui selon lui était une substance qui coulait dans les artères avec le sang. Dépassant les doctrines médicales de l'époque, Hérophile professait que les maladies survenaient lorsque l'excès de l'une des quatre humeurs empêchait le pneuma d'atteindre le cerveau.
Il fut aussi le premier à découvrir que les artères transportaient du sang et non de l'air, le premier à démontrer le rôle du cœur dans les pulsations, rôle qu’il compara à la respiration. Après avoir étudié l'écoulement du sang, il a été capable différencier les artères et les veines. Il a remarqué que lorsque le sang coulait à travers les artères, elles étaient le siège d’une pulsation rythmique. Il a travaillé sur des méthodes de mesure du pouls et utilisé ces techniques comme aide au diagnostic des maladies. Pour mesurer le pouls, il avait fabriqué une clepsydre.
Grâce à la dissection de l’œil, il a découvert les différentes parties et les membranes de l'oeil: la cornée, la rétine, l’iris et la choroïde.
Hérophile a également introduit un grand nombre de termes scientifiques utilisés de nos jours pour décrire les phénomènes anatomiques. Il a été parmi les premiers à introduire la notion de terminologie classique, par opposition à l'utilisation de " noms naturels ", en utilisant des termes qu'il avait créé pour décrire ses objets d’études, en les nommant pour la première fois. Le confluent des sinus du crâne a été désigné après lui sous le terme de torcular Herophili. Torcular est une traduction latine du terme d’Hérophile, Lenos, 'vin de cuve' ou 'vin de presse'. Il a également nommé le dua denum (Duodénum), qui est une partie de l’intestin grêle. Hérophile est réputé avoir étudié la physiologie du système reproducteur. Dans son livre intitulé les sages-femmes, il a évoqué les étapes et la durée de la grossesse ainsi que les causes d'un accouchement difficile. L'objectif de ce travail était d'aider les sages-femmes et les autres médecins de l'époque à mieux comprendre le processus de la procréation et de la grossesse. On lui attribue la découverte de l’ovule. Ses travaux d’anatomie concernent aussi d'autres domaines le foie, le pancréas, l'appareil digestif, ainsi que les organes salivaires et génitaux.
Hérophile pensait que l’activité physique et une alimentation saine, faisaient partie intégrante de la santé corporelle d'un individu. Hérophile a dit que : "quand la santé est absente, la sagesse ne peut pas se révéler, l'art ne peut pas se manifester, la force ne peut pas être utilisée pour combattre, la richesse devient inutile et l'intelligence ne peut pas être mise en oeuvre."