La première idée d'une Université en Franche-Comté à Gray remonte en 1287 à Othon IV, alors souverain du Comté de Bourgogne. Mais il faut attendre 1423 pour que le duc Philippe le Bon ouvre à Dole l'Université des deux Bourgognes (la "ducale", l'actuelle Bourgogne et la "comtale", l'actuelle Franche-Comté) qui comprend trois facultés : théologie, droit canon et droit civil, médecine. Le corps professoral, essentiellement comtois, est renforcé de temps à autre de quelques "ténors" étrangers recrutés à prix d'or, notamment des juristes italiens, dont Anselme de Marenches et Nicolas Belloni, qui donnent à Dole un rayonnement international. En 1562, Dole compte 268 étudiants, dont 45 comtois et 223 étrangers. Un siècle plus tard, les étudiants originaires des Pays-Bas espagnols (Hollande et Belgique actuelles) sont encore assez nombreux pour se grouper en une "nation flamande".
Mais Dole, punie pour avoir trop longtemps résisté à la conquête française, perd son rôle de capitale de Franche-Comté au profit de Besançon où Louis XIV transfère l'Université en 1691. Ce transfert ne se réalise pas sans difficulté : c'est Louis XIV qui octroie des subsides de fonctionnement à l'Université, la ville ayant refusé toute aide financière. Malgré ces débuts difficultueux, l'Université, qui se compose de trois facultés - théologie, droit, médecine - participe au grand épanouissement que connaissent la ville et la province au XVIII siècle. Une ombre est portée au tableau cependant avec l'ouverture à Dijon, en 1723, d'une faculté de droit canon et de droit civil, en dépit de la promesse du Roi selon laquelle il n'y aurait qu'une Université pour les deux Bourgognes (Louis XV ouvrira plus tard à Besançon une chaire de droit public, véritable innovation au royaume de France).
Sous Louis XVI, les crises politiques, sociales, économiques et financières, latentes ou patentes, reléguent dans la pénombre l'Université dont les ressources s'amenuisent. Le coup de grâce est donné par le décret de la Convention du 15 septembre 1793 qui supprime toutes les universités de l'ancien régime.
Napoléon rétablit l'enseignement supérieur en faisant peu de cas toutefois d'un passé prestigieux : l'enseignement médical est régularisé, mais l'académie de Besançon ne reçoit, officiellement, que les facultés de théologie, de sciences et de lettres, sans obtenir la faculté de droit. Dans les faits, la faculté des lettres est la seule faculté comtoise jusqu'en 1845, puisque la théologie n'est représentée que par les cours du Grand séminaire et la faculté des sciences, victime des compressions budgétaires de la Restauration, en est restée au stade de l'inauguration. A la rentrée universitaire de 1845, sous la pression massive des personnalités locales, Paris vote les crédits nécessaires et la faculté des sciences peut enfin fonctionner.
À la fin du XIXe siècle, à la faveur de l'impulsion donnée par la III République, divers aménagements et créations consolident l'Université qui, en particulier, s'enrichit d'un Observatoire en 1882, et réorganise l'école de médecine en 1889. Le nombre des étudiants, longtemps modeste (au point que Paris émet à plusieurs reprises des projets de suppression de facultés bisontines), commence à se redresser et passe de 180 en 1890, à 245 en 1900.
Au XXe siècle, l'université poursuit son chemin vers de nouvelles conquêtes, quelquefois durement acquises. En 1920 elle obtient, avec le concours de la ville, la création d'une école de droit (les cours sont donnés par des praticiens, magistrats, membres du Barreau, hauts fonctionnaires... et les examens sont passés à Dijon) et en 1964, la création d'un Collège universitaire de droit, placé sous la tutelle scientifique de la faculté de droit de Dijon.
Le brutal gonflement des effectifs après la Deuxième Guerre mondiale (600 étudiants en 1938, 780 en 1945, 3 300 en 1963, 11 000 en 1972) écarte définitivement les menaces de suppression et permet de transformer en facultés de plein exercice, l'école de médecine (1967) et le collège de droit (1968). Dans le même temps, sont créés les IUT (1967), l'UER d'éducation physique et sportive (1975), le Centre de Linguistique Appliquée (1961), et se construisent le bâtiment des sciences naturelles place Leclerc (1957), le campus de la Bouloie (à partir de 1962), tandis que la faculté des lettres amorce son extension sur place, entre les rues Mégevand et Chifflet.
