Le Squadron 49 de la RAF reçut ses premiers Hampden en septembre 1938. Le Flight Lieutenant Rod Learoyd (en) de cette unité reçut la Victoria Cross pour l'attaque qu'il avait commandée contre l'aqueduc de Dortmund-Ems le 12 août 1940. Le sergent John Hannah (en), un opérateur radio / mitrailleur du Squadron 83 reçut également la Victoria Cross après avoir combattu l'incendie qui ravageait son Hampden, permettant de ramener l'appareil et l'équipage sain et sauf en Angleterre.
Au début de la Seconde Guerre Mondiale, un total de 226 Hampden étaient en service dans huit squadrons de la RAF. En dépit de sa vitesse et de son agilité, le Hampden ne pouvait pas beaucoup résister aux chasseurs de la Luftwaffe. Sa carrière en tant que bombardier de jour fut donc brève, mais le Hampden continua à effectuer des missions de bombardement de nuit sur l'Allemagne ainsi que missions de mouillage de mines en Mer du Nord (nom de code "gardening" ou jardinage)
Près de la moitié des Hampden construits (714) ont été perdus en opération, emportant dans la mort 1077 membres d'équipages et 739 disparus. La flak allemande en descendit 108. Un Hampden fut la victime d'un barrage balloon (en) allemand. 263 autres Hampden furent perdus pour des causes "diverses" et finalement 214 furent déclarés "disparus". Les pilotes de la Luftwaffe ont revendiqué des victoires sur 128 Hampden dont 92 de nuit. Guy Gibson a passé la majeure partie de ses deux années de service de guerre en volant sur des Hampden et son livre "Enemy Coast Ahead" donne une bonne idée des essais et tribulations pour amener ces appareils au combat.
Après son retrait du service actif du Bomber Command en 1942, le Hampden prit du service en 1943 au Coastal Command en tant que bombardier-torpilleur et appareil de reconnaissance maritime. Le Hampden TB Mk I volait avec une torpille Mk XII dans une baie ouverte et une bombe de 127 kg sous chaque aile. Les Squadron 144 et 455 de la RAAF participèrent à l'escorte des convois arctiques en opérant à partir de bases soviétiques. À la fin de leur mission, ils laissèrent 23 de leurs appareils pour l'aviation Navale Soviétique qui les utilisa dans le 3e escadron du 24 MTAP (Escadre de lutte anti-navires) au moins jusqu'à la fin de 1943.
Le Hampden fut également utilisé par les RCAF et RNZAF.
Après guerre, 200 appareils furent transférés au Canada où ils furent utilisés pour l'entrainement au bombardement et au tir.