Les apports de Jacques Monod à la biologie moléculaire sont considérables. Intéressé par la génétique des micro-organismes, il postule puis mettra en évidence l'existence d'une molécule servant de lien entre le génome (ADN) et les protéines : l'ARN messager. Avec François Jacob, corécipiendaire du prix Nobel la même année, il démontre la notion d'opéron dans les bactéries. Un opéron étant une unité génétique composée de plusieurs enzymes dont l'expression est régulée par le même promoteur. La notion de promoteur est aussi due à ces deux scientifiques.
Il élabore en 1965 avec Jean-Pierre Changeux et Jeffries Wyman le concept d'allostérie, un mode de régulation majeur des enzymes. L'article publié dans le Journal of Molecular Biology est l'un des plus cités au monde.
Jacques Monod a obtenu le Prix Nobel parce qu’il a montré que l’ADN est le point de départ des réactions biochimiques qui, par l’intermédiaire de l’ARN, produisent les protéines nécessaires à la vie des cellules. Pour Monod, l’ADN a le rôle primordial d'un centre de commande dans le métabolisme cellulaire. Avec François Jacob, il est un de ceux qui ont popularisé l'idée qu'un programme génétique dirige la vie et le développement des êtres vivants.
Fort de son succès, il publie un livre, Le Hasard et la Nécessité, en 1970, dans lequel il écrit le passage suivant : « Il n’est ni observé, ni d’ailleurs concevable, que l’information soit jamais transférée dans le sens inverse (c’est-à-dire de l’ARN vers l’ADN). C’est l’un des principes fondamentaux de la biologie moléculaire. »
Cette affirmation, qui n'est que la reprise du dogme central de la biologie moléculaire énoncé par Francis Crick en 1958, ne s'est pas avérée dans le domaine de la virologie : les rétrovirus, comme le VIH ou le virus de la grippe possèdent une information génétique conservée sous forme d'ARN et rétro-transcrite en ADN au moment de son insertion dans le génome de l'hôte. Cette rétro-transcription est rendue possible par la transcriptase inverse, dont la description a été publiée la même année par Howard Temin. En 1989, l'existence de la transcriptase inverse bactérienne fut confirmée par S. Inouye et W. Maas aux USA.