L'ancêtre de l'actuel jardin botanique de Rome est le Simpliciarius Pontificius Vaticanus (c'est-à-dire le « jardin des simples » où se cultivaient les plantes utiles et médicinales, toujours présent dans les monastères) mentionné sous le pontificat de Boniface VIII.
Un peu plus tard, à la fin du XIII siècle, une inscription aujourd'hui au Capitole mentionne un Pomerius voulu par le pape Nicolas III sur la colline du Vatican : il s'agissait toutefois encore d'un terrain agricole - vigne, verger, herbes médicinales - sur le site occupé de nos jours par les jardins et les palais du Vatican, destiné aux cultures pour le service de la cour pontificale.
Le premier véritable jardin botanique de Rome fut voulu au XVIe siècle par Alexandre VI, et ultérieurement reconstruit par Pie IV, qui le dota d'un gardien (qui faisait aussi fonction de guide). Pie V agrandit le jardin en le confiant au botaniste Michele Mercati. Après une période d'abandon, le pape Alexandre VII en fit l'un des principaux jardins botaniques d'Europe, utilisant l'eau des aqueducs de Rome quee Paul V avait installés d'Albano au Janicule.
Bien que la première chaire universitaire de botanique ait été instituée à Rome en 1513 et que les étudiants et les enseignants pouvaient jouir pour leur observations du jardin botanique du Vatican, ce dernier restait de statut très privé.
Le premier terrain destiné à cet usage fut donné à l'Université par le pape Alexandre VII Chigi en 1660.
C'est seulement avec la réunification de l'Italie, en 1883, que le jardin botanique de Rome est installé sur son emplacement actuel, quand l'État acquiert la propriété de jardins de la Villa Corsini.
Le premier directeur, celui qui dans le parc Corsini pratiquement abandonné fit installer les premières collections, fut Pietro Romualdo Pirotta.