Microscope confocal à balayage laser

Le microscope confocal à balayage laser — MCBL (en anglais CLSM pour confocal laser scanning microscope) est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 600 nm) appelées « sections optiques ». En positionnant le plan focal l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet.

L'objet n'est pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par ordinateur.

Le microscope confocal fonctionne en lumière réfléchie ou en fluorescence.

Le principe du microscope confocal a été décrit par Marvin Minsky en 1953, mais ce n’est que dans la fin des années 1980 que des modèles commerciaux sont apparus, rendant cette technique accessible à de nombreux laboratoires. La microscopie confocale est très utilisée en biologie ainsi qu’en sciences des matériaux.

En microscopie optique classique, pour qu'une image soit nette, il faut que l'objet soit dans le plan focal du système optique. Lorsqu'un objet est épais, présente un relief important, ou bien lorsqu'il est incliné par rapport à l'objectif, seule une partie de l'objet est nette dans l’image (voir l'article sur la profondeur de champ).

Pour résoudre ce problème, on éclaire la surface non plus par un faisceau de lumière blanche, mais par un rayon laser, concentré par une lentille, qui balaie la surface en positionnant une sténopée (pinhole en anglais) devant le détecteur, dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif (plans confocaux). De cette manière, seuls les photons provenant du plan focal passent la sténopée et participent à la formation de l’image, d'où le nom « confocal » (synonyme de monofocal).

Le balayage par le laser se fait à l’aide de deux miroirs orthogonaux. Les détecteurs utilisés sont des tubes photo-multiplicateurs (PMT), l’intensité lumineuse est mesurée et numérisée en fonction de la position du laser dans l’échantillon : on obtient directement des images numériques.

L’emploi d’une source lumineuse cohérente (laser) ainsi que la taille réduite du champ éclairé permettent d’obtenir une résolution latérale légèrement meilleure (180-160 nm) à celle attendue pour un microscope optique conventionnel (200 nm). La résolution en Z (profondeur) est de l’ordre de 600 nm en microscopie confocale.

Les lasers utilisés le plus fréquemment sont les suivants :

• argon-ion (longueurs d'onde : 457nm, 488nm, 514nm)
• hélium-néon (543nm)
• hélium-néon (633nm)

Le positionnement de l’image dans la profondeur de l’échantillon est généralement obtenue en déplaçant en Z l’objectif à l’aide d’un quartz piezo-électrique par pas successifs de 200-300nm.

Microscopie de fluorescence par excitation multiphotonique

Technique très similaire à la microscopie confocale à balayage laser elle emploie le même matériel. La faible profondeur de champ est obtenue en n’excitant la fluorescence que dans un volume restreint par excitation multiphotonique à l’aide de lasers pulsés. Cette excitation consiste en l'absorption quasi-simultanée de plusieurs photons d'excitation d'une longueur d'onde proche d'un multiple de l'excitation optimale à un photon. La totalité de la fluorescence arrive au niveau du détecteur, il n’y a plus de sténopée. On ne peut donc plus parler de microscopie confocale, bien qu’on emploie quelquefois le terme de microscopie confocale multiphotonique de manière abusive. Bien souvent les applications sont limitées à la microscopie biphtonique (excitation du fluorophore par deux photons). Outre l'aspect d'excitation naturellement confocale, cette technique est utilisée pour l'excitation simultanée de plusieurs fluorophores à spectres d'émission différents.

Microscope à fluorescence par excitation multiphotonique multifocale (triMscope)

Le principe est identique, mais le faisceau laser est divisé en plusieurs faisceaux ce qui permet de balayer simultanément plusieurs points. Ceci permet de diminuer le temps d’acquisition des images.

Microscope de fluorescence par réflexion totale interne

permet d’obtenir une meilleure profondeur de champ (200 nm) que la microscopie confocale (600 nm), mais uniquement à la base de l’échantillon (plus précisément au niveau de l’interface échantillon/support transparent.

Autres techniques

• Microscope Confocal à Disque Rotatif (ou disque de Nipkow - spinning disk).
• Microscope confocal spectral.
• Spectroscopie par corrélation de fluorescence