Willstatter a soutenu son doctorat à l'université de Munich en 1894, sur la structure de la cocaïne. Il est ensuite devenu assistant de Adolf von Baeyer à Munich, a continué ses recherches sur la structure des alcaloïdes et en a synthétisé plusieurs.
En 1905, il est devenu professeur à l'université de Zurich et a commencé à étudier la chlorophylle. Il a trouvé sa structure et montré que la structure du pigment sanguin « heme » ressemblait au composé de porphyrine présent dans la chlorophylle. Il a réussi, le premier, à synthétiser le cyclooctatétraène. Il est ensuite devenu professeur de chimie à l'université de Berlin et directeur de l'Institut Kaiser-Wilhelm (1912-1916). Ses recherches ont révélé la structure de nombreux pigments des fleurs et des fruits. Lorsque son travail fut interrompu par la Première Guerre mondiale, il se tourna vers le développement d'un masque à gaz.
Il est lauréat du prix Nobel de chimie de 1915 « pour ses recherches sur les pigments des plantes, spécialement la chlorophylle ».
En 1916, Willstatter succéda à Baeyer à Munich. Pendant les années 1920, il étudia les mécanismes des réactions enzymatiques et tenta de montrer que les enzymes sont des substances chimiques et non des organismes biologiques. Étant Juif, il démissionna de son poste à Munich en 1924 pour protester contre les pressions antisémites. Il continua ses recherches à titre privé, d'abord à Munich puis en Suisse après 1939.