L'hôpital du Saint Esprit a été fondé à Besançon en 1207 par l'Ordre Hospitalier du Saint-Esprit. La chapelle a probablement été édifiée entre 1207 et 1220. Le choeur agrandi dans les années 1300. . L'hôpital accueille durant tout le Moyen Âge les malades, femmes enceintes, vieillard, voyageurs et orphelins . Cependant, l'hospice limite son aide aux orphelins, aux femmes enceintes ainsi qu'au voyageurs à partir du XVI siècle après des accords avec la municipalité de Besançon. En 1792, l'édifice prend le nom d'hospice des enfants de la patrie avant d'être transféré en 1797 à l'Hôpital Saint-Jacques récemment construit, ce dernier devant être l'hôpital central de la ville .
La ville de Besançon, qui s'était montrée particulièrement hostile face au culte réformé, devait cependant fournir un local pour les soldats protestants jusqu'à la Révolution française. Cette hostilité est peu à peu oubliée quand les horlogers suisses, qui étaient pour la plupart calvinistes, introduisirent l'industrie horlogère en Franche-Comté. C'est ainsi que les protestants de la ville se voient attribuer la chapelle du Refuge en 1793, puis l'ancienne chapelle des Capucins en 1805 (qui s'appellera par la suite temple de Chamars) et enfin l'église du Saint-Esprit.
En 1842, le bâtiment est officiellement cédé aux protestants de la ville. Lors de travaux de réhabilitation de 1841, l'architecte bisontin Alphonse Delacroix dote l'église d'un nouveau porche néogothique de style troubadour. Le 28 avril 1842 eut lieu la dédicace du temple du Saint-Esprit. En 1975, l'église réformée devient propriétaire de la Tour du Saint-Esprit dite "Carrée" (classée Monument Historique) attenante à la chapelle de l'ancien hôpital, construite de 1447 à 1450 sur un bâtiment plus ancien du XIIIe siècle par frère Lambert Vernier de Vélesme .
Dans le temple se trouvent:
. la plaque tombale du Recteur Pierre de Navarret, 1414, classée,
. l'ancienne chapelle "Notre Dame de la Gésine" construite vers 1480 par le Recteur Guillaume Bercy
. un orgue Frères Callinet de 1837 (classé Monument Historique) transféré de l'ancien temple de Chamars,
. le mobilier dessiné par l'architecte Alphonse Delacroix (bancs)
