Après le départ de Claude Jourdan du Muséum d'histoire naturelle de Lyon, Louis Lortet obtint le poste de directeur dans un contexte peu favorable avec la guerre franco-prussienne qui éclata en 1870. Ces événements contrevinrent à ses projets de visiter les autres grands musées européens dont il souhaitait s'inspirer pour diriger le Muséum de Lyon. Après avoir dressé un tableau dramatique des collections de zoologie laissées dans un état effroyable, à ses dires, par son prédécesseur, Louis Lortet eut pour première mission de remettre en état les collections.
Il s'entoura d'une équipe très compétente de naturalistes lyonnais, parmi lesquels figuraient Ange Paulin Terver, Arnould Locard, Falsan, Godard, Eugène Dumortier… qui l'aidèrent pour le classement, la détermination des spécimens. Dans le même temps, il fonda l'Association lyonnaise des Amis des sciences naturelles, destinée à acquérir des pièces spectaculaires comme le Mégacéros ou financer le montage du Mammouth de Choulans découvert en 1859, tandis qu'il faisait appel à la générosité des naturalistes lyonnais, des membres des sociétés savantes, comme la Société physiophile de Lyon ou la Société linnéenne de Lyon, afin d'obtenir des doubles d'insectes ou de coquilles. En quelques années, les efforts de Louis Lortet furent récompensés, les collections du Muséum de Lyon s'enrichirent considérablement et bientôt le Muséum de Lyon échangeait avec la plupart des muséums européens.
Il effectua de très nombreuses missions au Proche-Orient et eut plusieurs naturalistes en poste en Cochinchine, comme Gilbert Tirant et Albert Morice qui lui expédiaient régulièrement des caisses d'animaux dont beaucoup étaient nouveaux pour le Muséum et pour la science. Ernest Chantre lui faisait parvenir de ses nombreuses missions dans le Moyen-Orient et le Caucase, toutes sortes d'animaux surtout invertébrés qui venaient s'ajouter aux dons de plus en plus fréquents. Il constitua avec ce dernier une très importante collection de plusieurs milliers de crânes humains.
Louis Lortet fonda également une revue destinée à recevoir les articles de recherche effectuées par Lortet et ses collaborateurs : les Archives du Muséum d’histoire naturelle de Lyon, d'imposants fascicules abondamment illustrées par des lithographes du Muséum. Les travaux de recherche de Louis Lortet sont très nombreux et couvrent de nombreux domaines ; on lui doit, entre autres, des descriptions de poissons nouveaux du lac de Tibériade. En 1875, il faisait part à l'Académie des sciences de sa découverte des mœurs étonnantes des Chromis du lac de Tibériade : c'est à Louis Lortet qu'on doit la découverte de l'incubation buccale chez ces espèces.
À partir de 1900, ses recherches s'orientent vers l'égyptologie et publiera avec Claude Gaillard, qui sera son successeur en 1909, un important ouvrage sur la faune momifiée de la Haute-Égypte. Les voyages qu'il réalisait, en Syrie et en Égypte, avaient pour objectif de rapporter toutes sortes d'objets d'histoire naturelle (fossiles, coquilles, insectes...) mais aussi d'étudier les mœurs locales.
Il est sans conteste, le personnage qui a le plus marqué l'histoire du Muséum de Lyon qui à son époque rayonnait au niveau international, tandis que les collections publiques et les nouvelles vitrines attiraient plus de 500 000 visiteurs par an.
