Fils de Thomas Moffet, Thomas Muffet naît vers 1552 à Shoreditch (un quartier de Londres). De 1560 à 1568, Muffet étudie à la Merchant Taylor's School. L'année suivante, en mai 1569, il entre au Trinity College de Cambridge. Il n'y reste cependant que deux ans et demi. En octobre 1572, Muffet est transféré à Gonville Hall. Il y poursuit ses études jusqu'à l'obtention de son bachelor en 1573. Ensuite, Muffet débute l'étude de la médecine avec Thomas Lorkin (v. 1528–1591) et John Caius (1510-1573). Trois ans plus tard, il entreprend sa maîtrise au Trinity College, ce qui explique son renvoi de Gonville Hall. En 1579, Muffet obtient son doctorat en médecine à Bâle, avec une version censurée de sa thèse, titrée De amodinis medicamentis.
Après avoir obtenu son diplôme, en 1580, Thomas Muffet étudie l'anatomie des vers à soie en Italie, avant de rentrer définitivement en Angleterre. En décembre de la même année, il épouse sa première femme, Jane, à St. Mary Colechurch à Londres. Deux ans plus tard, il est reconnu en tant que médecin qualifié par le College of Physicians de Londres, malgré la position de Muffet en faveur du système médical de Paracelse, qui n'est pas largement accepté, à l'époque, par la communauté médicale. La même année, Muffet rencontre Tycho Brahe (1546-1601) et Petrus Severinus (1542-1602). Deux ans plus tard, en 1584, Muffet termine son ouvrage De jure et praestantia chemicorum medicamentorum. La même année, Muffet écrit une lettre attaquant le College of Physicians de Londres pour ses influences trop papistes selon ses propres croyances puritaines. Il y est cependant admis l'année suivante et devient membre en février 1588. Plus tard la même année, Muffet publie son Nosomantica Hippocratea, soutenant le travail et les écrits d'Hippocrate. Neuf ans plus tard, en octobre 1597, Muffet est élu membre du parlement de Wilton. Trois ans plus tard, en 1600, la femme de Muffet, Jane, meurt. Il se marie alors avec Catherine Brown la même année. Quatre ans plus tard, le 5 juin 1604, Thomas Muffet meurt à la Bulbridge Farm, Wilton dans le Wiltshire.