Le choléra des poules
Il étudie avec Pasteur le choléra des poules (1879-1880).
Le charbon et l'expérience de Pouilly-le-Fort
Il étudie également avec Pasteur le charbon (1879-1890), et participe à l'expérience célèbre de Pouilly-le-Fort, expérience publique de vaccination d'animaux contre le charbon.
En mai 1881, à Pouilly-le-Fort, près de Melun, Pasteur réalise une grande expérience de vaccination contre le charbon sur 50 moutons. Il prépare deux lots de 25. Le premier lot reçoit, à 15 jours d'intervalle, deux injections de vaccin anti-charbonneux préparé par Pasteur et ses collaborateurs. Puis les deux lots reçoivent une injection de culture vivante de bacille charbonneux. Tous les animaux non vaccinés meurent. Tous les vaccinés survivent. Pasteur, qui n'est pas médecin mais chimiste, est désormais célèbre.
Se référant aux souvenirs publiés en 1937-1938 par le bactériologiste Adrien Loir, neveu et ancien assistant-préparateur de Pasteur, Émile Lagrange , biographe d'Émile Roux, écrit :
« En réalité, [Émile Roux] n'est pas seulement l'exécutant de Pasteur, il peut se rendre cette justice d'avoir, avec Chamberland, sauvé le prestige de son patron. C'est lui le vrai vainqueur de Pouilly-le-Fort. [...] Ce n'est qu'en 1883, dans deux notes successives, que sera dévoilé le procédé d'atténuation découvert par Chamberland et Roux, Pasteur ayant refusé jusque là qu'il soit publié. Ils l'annoncent comme un fait divers ; c'est la clé de la méthode. Roux est obligé d'y revenir en 1890, pour attirer l'attention sur ce travail considérable qui est passé inaperçu. »
La rage
En 1883, Roux présente sa thèse de doctorat, intitulée Des Nouvelles Acquisitions sur la Rage, Paris, où il décrit les recherches qu'il mène avec Pasteur sur ce sujet depuis 1881, et qui devaient conduire à la première vaccination contre cette maladie redoutable. Roux est alors reconnu comme un expert dans les sciences nouvelles qu'étaient la microbiologie médicale et l'immunologie.
Les travaux sur d'autres maladies infectieuses
Avec d'autres assistants de Pasteur, Edmond Nocard (1850-1903), Louis Thuillier (1856-1883) et Isidore Straus (1845-1896), il se rend en 1883 en Égypte, pour y étudier une épidémie de choléra humain. Ces chercheurs échouent cependant dans leur tentative d'isoler le germe responsable de cette maladie, lequel ne devait être découvert que plus tard à Alexandrie par le médecin allemand Robert Koch (1843-1910).
La diphtérie et le sérum antidiphtérique
En 1888, il publie avec Alexandre Yersin (1863-1943) le premier de ses travaux classiques sur l'origine de la diphtérie, due au bacille de Klebs-Loeffler, maladie alors très fréquente et mortelle, particulièrement chez les enfants. Loeffler avait pressenti que le bacille produisait son effet par une toxine, mais n'avait pas isolé cette toxine, ce qui fut l'œuvre de Roux et Yersin. Il s'agissait d'ailleurs de la première toxine isolée dans l'histoire de la microbiologie. Roux en étudie les propriétés et commence en 1891 à mettre au point un sérum efficace pour traiter la maladie, après qu'Emil Adolf von Behring (1854-1917) et Shibasaburo Kitasato (1852-1931) ont démontré qu'il était possible de produire chez des animaux des anticorps contre la toxine diphtérique. Roux, Martin et Chaillou testèrent l'efficacité thérapeutique du sérum antidiphtérique sur des enfants à l'Hôpital Trousseau et à l'Hôpital des Enfants-Malades. Le résultat fut : 316 morts sur 520 traités par les méthodes classiques, 109 morts sur 448 traités par le sérum. Ce succès valut à Roux d'être salué comme héros de la science dans les congrès médicaux partout en Europe.
L'Institut Pasteur
En 1883, et pendant les quarante années qui suivent, Émile Roux est très impliqué dans la création de ce qui devait être l'Institut Pasteur, et il partage son temps entre la recherche biomédicale et ses devoirs administratifs. En 1888, année importante dans sa carrière, il accepte le poste de directeur des services, et entre au conseil de rédaction des Annales de l'Institut Pasteur. Dans le même temps, il crée le premier cours régulier sur la technique microbiologique, qui devait avoir une influence considérable dans la formation aux maladies infectieuses d'un grand nombre de chercheurs et de médecins français et étrangers voués à la célébrité.
Dans les années suivantes, Roux se dépense sans compter dans un grand nombre de recherches sur la microbiologie et l'immunologie pratique du tétanos, de la tuberculose, de la syphilis et de la pneumonie. En 1903, il reçoit le prix Osiris, dont il reverse le montant de 100 000 francs à l'Institut Pasteur.
En 1904, il est nommé directeur général de l'Institut Pasteur (à l'ancien poste de Pasteur). Il est le président d'honneur du Congrès de chirurgie de 1922. Durant la Première Guerre mondiale, il est au Conseil d'hygiène de l'armée.