C'est en 1551, après avoir brillamment guéri François de Lorraine, duc de Guise, que Paré fut nommé Premier Chirurgien du Roi.
En 1553, il est prisonnier au siège de Hesdin (Vieil Hesdin actuellement avant sa destruction par Charles Quint). Cherchant une reconnaissance officielle, Paré décide d'obtenir le titre de docteur en chirurgie ; ses "confrères" tentent de s'y opposer mais l'appui du roi est le plus fort et il reçoit le titre tant convoité le 8 décembre 1554, sans avoir eu à passer les épreuves de latin.
À 45 ans, il est chirurgien barbier dans une échoppe ; les barbiers-chirurgiens ont fondé la Confrérie de Saint-Côme. Il a acquis une grande expérience pendant la guerre d'Italie et sur les autres champs de bataille. Ses Œuvres sont le résultat de 40 ans de pratique.
En 1561 et 1562, il publie deux autres ouvrages dont son Anatomie universelle du corps humain. Il devient premier chirurgien auprès du roi Charles IX. Paré est renvoyé au secours des armées, d'abord à Rouen, puis à Dreux et au Havre. Les guerres de religion opposant catholiques et protestants (huguenots) ont repris de plus belle, ensanglantant le pays pour les trente années à venir. De 1564 à 1566, Paré accompagne Charles IX en visite à travers la France et en profite pour débusquer de nouvelles pistes de recherches.
La plus grande innovation est de ligaturer ou de panser avec un mélange de jaune d'œuf, d'huile rosate et de térébenthine plutôt que de brûler les plaies. Il jure de ne plus brûler aussi cruellement les pauvres blessés. C'est entre Charles IX et Ambroise Paré qu'aura lieu cet échange verbal :
« — J'espère bien que tu vas mieux soigner les rois que les pauvres ?
— Non Sire, c'est impossible.
— Et pourquoi ?
— Parce que je soigne les pauvres comme des rois »
À la Saint-Barthélemy, il est protégé par la famille des Guise. Ferme dans ses convictions huguenotes, il aurait, dit-on, répondu au roi qui tentait de le convaincre d’abjurer : « Par la lumière de Dieu, Sire, je crois qu'il vous souvient m’avoir promis de ne me commander jamais quatre choses, savoir : de rentrer dans le ventre de ma mère, de me trouer à un jeu de bataille, de quitter votre service et d’aller à la messe. »
Veuf en 1573, il se remarie le 18 janvier 1574 avec Jacqueline Rousselet et aura 6 autres enfants, le dernier à 73 ans. Un de ses petit-fils est François Hédelin. Couronné en 1574, Henri III de France le garde auprès de lui en tant que premier chirurgien.