Comme pour Europe et Ganymède, certains scientifiques ont émis l'hypothèse que des formes de vie microbiennes extraterrestres puissent exister dans un hypothétique océan salé sous la surface de Callisto. Cependant, les conditions seraient beaucoup moins favorables à l'apparition de la vie sur Callisto que sur Europe, en raison de l'absence possible de contact entre l'océan et le noyau rocheux (qui empêcherait la présence de monts hydrothermaux et au plus faible flux de chaleur se dissipant des couches internes de Callisto. Le chercheur Torrence Johnson a déclaré à propos de la probabilité d'existence de la vie sur Callisto comparée à celle sur les autres lunes galiléennes :
« Les ingrédients de base de la vie — ce que nous appelons la « chimie prébiotique » — sont abondants sur de nombreux objets du système solaire, comme les comètes, les astéroïdes et les lunes glacées. Les biologistes pensent que l'eau liquide et de l'énergie sont nécessaires pour abriter la vie, et il est donc intéressant de trouver un endroit où pourrait se trouver de l'eau liquide. Mais, concernant l'énergie, l'océan de Callisto est uniquement chauffé par les éléments radioactifs, tandis qu'Europe a aussi de l'énergie produite par les forces de marées dues à sa plus grande proximité de Jupiter. »
En se basant sur les considérations déjà évoquées et sur d'autres travaux scientifiques, Europe serait la lune galiléenne ayant le plus de chance d'abriter des formes de vies microbiennes.