Chromatographie d'exclusion stérique - Définition

Introduction

Appareil de chromatographie d'exclusion stérique. Le pompage de l'éluant dans la colonne de droite est contrôlé par l'ordinateur.

La chromatographie d'exclusion stérique (SEC d'après l'anglais Size Exclusion Chromatography) ou chromatographie sur gel perméable (GPC d'après l'anglais Gel Permeation Chromatography) ou encore Gel Filtration Chromatography est une méthode de chromatographie en phase liquide permettant de séparer des macromolécules en fonction de leur volume hydrodynamique. Elle est notamment utilisée pour évaluer la distribution des volumes hydrodynamiques dans un échantillon de polymères.

Principes de l'exclusion stérique

Schéma simplifié du principe de la chromatographie d'exclusion stérique. Le chromatogramme représente la séparation de 3 polymères de tailles différentes en solution. Les molécules ayant le plus grand volume hydrodynamique (1) arrivent en tète, suivies des plus petites (2) puis (3).

Contrairement aux méthodes de chromatographie d'affinité (comme l'High Performance Liquid Chromatography), le principal phénomène physique permettant la séparation des différentes macromolécules constituant le polymère n'est pas basé sur l'affinité chimique avec le support, mais idéalement sur la taille des macromolécules en solution (leur volume hydrodynamique). En réalité, ces deux mécanismes de séparation sont continuellement en compétition au sein de la colonne; les conditions expérimentales sont alors établies pour minimiser les mécanismes enthalpiques d'affinité au profit de ceux entropiques d'exclusion stérique. Le mécanisme d'exclusion stérique est fondé sur l’équilibre thermodynamique entre deux phases, le solvant interstitiel dans le volume mort V₀ et le solvant contenu dans le volume poreux V_p. Si K est le coefficient de partage, le volume d’élution V_e d’une macromolécule est défini par :

L’évolution du coefficient de partage K en fonction, d’une part de la taille de la chaîne macromoléculaire et de sa topologie, d’autre part de la distribution de la taille des pores, a une origine purement entropique. La fonction de partage d’une chaîne de taille donnée, à l’intérieur d’un pore de volume V_p dont la paroi est impénétrable, peut être obtenue par l’énumération de toutes les conformations possibles prises au hasard. Les macromolécules dessinées en ligne continue correspondent aux conformations autorisées et les macromolécules dessinées en pointillé correspondent aux conformations impossibles car franchissant la paroi. Le coefficient de partage est lié au rapport des nombres des conformations autorisées et impossibles. Suivant leur taille, les molécules éluées peuvent plus ou moins pénétrer dans les pores de la phase stationnaire, un gel polymère dont sont remplies les colonnes. Ainsi, les molécules les plus petites sont d'avantage retenues que les plus grosses, d'où un temps de rétention plus long pour les premières que pour les secondes. Chaque colonne possède un domaine de séparation spécifique: les macromolécules dont le volume hydrodynamique est trop important éluent dans le volume mort, tandis que celles trop petites éluent avec l'éluant en fin d'injection. L'analyse de données hors de ce domaine de séparation n'apporte donc aucune information. En sortie de colonne, des détecteurs (réfractomètre, diffusion de lumière, viscosimètre) fournissent des données relatives aux macromolécules sortant de la colonne à un instant donné.