Il développa la première formalisation de la mécanique quantique, en 1925, en même temps qu'Erwin Schrödinger. Toutefois le formalisme mathématique était différent ; Heisenberg adopta une formalisation matricielle, la « mécanique matricielle », alors que Schrödinger utilisa une approche par les équations différentielles. Pour cette raison, on crut d'abord que les deux théories étaient distinctes, mais l'année suivante, Schrödinger établit l'équivalence mathématique des deux formulations. Heisenberg redécouvrit d'ailleurs à cette occasion les principaux résultats du calcul matriciel pour les besoins de l'expérimentation ; la théorie complète des matrices ne lui fut enseignée que plus tard par le physicien allemand Pascual Jordan.
Son principe d'incertitude, découvert en 1927, affirme que la détermination de certains couples de valeurs, par exemple la position et la quantité de mouvement, ne peut se faire avec une précision infinie. On peut le formaliser sous la forme d'un produit : Δpx Δx ≈ h où Δpx représente l'indétermination sur la quantité de mouvement, Δx l'indétermination sur la position et h la constante de Planck. Ce produit ne peut être inférieur à la constante h/4π (ou bien ħ/2, où ħ est la constante de Planck réduite) et donc toute précision dans la mesure d'une des deux quantités se fait au détriment de l'autre. Cette incertitude n'est pas liée à la mesure, mais est une propriété réelle des valeurs en question : améliorer la précision des instruments n'améliorera pas la précision de cette mesure simultanée.
À partir de 1929, il travailla avec Wolfgang Pauli à l'élaboration de la théorie quantique des champs.
Il reçut le prix Nobel de physique en 1932 pour « pour la création de la mécanique quantique, l'application de celle-ci a, entre autres, mené à la découverte des variétés allotropiques de l'hydrogène » (l'orthohydrogène et le parahydrogène).
Après la découverte du neutron par James Chadwick en 1932, Heisenberg proposa le modèle proton-neutron du noyau atomique, et s'en servit pour expliquer le spin nucléaire des isotopes.