Cytométrie en flux - Définition

Introduction

La cytométrie en flux (CMF) est une technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser, en les comptant et en les caractérisant.
C'est la lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) qui permet de classer la population suivant plusieurs critères et de les trier.

La cytométrie en flux est définie comme l’étude précise de particules isolées ou de cellules, bactéries...vivantes ou mortes) entraînées par un flux liquide ou gazeux. C’est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide.

Principe

Il s'agit d'analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser ou d’une lampe à arc.
Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs :

• aux propriétés optiques intrinsèques des particules ; ils correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne ou à l’auto-fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton, etc.
• aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.

Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photo-multiplicateurs (PMT), amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur par l'intermédiaire d'une composante informatique et optique (miroir dichroïque et filtre optique).

Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamétrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. L’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesurés et les représente sous la forme d’histogrammes (un paramètre) ou de cytogrammes (deux paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.

La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement une ou deux populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.

Les signaux recueillis

Les signaux optiques recueillis ont une intensité corrélée avec les propriétés particulaires.

La lumière diffusée

La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la structure de la particule. Si la diffusion de la lumière est mesurée dans l’axe du rayon incident, l’intensité du signal peut être corrélée avec la taille et la viabilité cellulaire.

Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de la cellule (réfringence du cytoplasme, granulosité, morphologie, rapport nucléo-cytoplasmique).

L’utilisation simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires.

La lumière absorbée

Cette mesure évolue proportionnellement au diamètre de la cellule (supposée sphérique) et à l’indice d’absorption des constituants bio-intra post cellulaires.

La fluorescence émise

Cette fluorescence peut être spontanée, mais le plus souvent, elle est apportée à la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée sous forme de photons d’une longueur d’onde plus élevée :

• fluorochromes à affinité propre pour un constituant cellulaire : par exemple pour les mesures d’ADN, d’ARN, de protéines, du pH, de calcium contenus dans la cellule ;
• fluorochromes couplés à un ligand spécifique. Cette spécificité peut être amenée par un couplage du fluorochrome à un anticorps ou un ligand spécifique supercopter d’un constituant cellulaire.
• tandem de fluorochromes, deux fluorochromes couplés à un anticorps, permet d'utiliser un fluorochrome qui ne serait normalement pas excité pour un laser donné. Le premier fluorochrome est donc excité par un laser, l'émission de longueur d'onde se trouvant dans le spectre d'émission du second, excite à son tour le deuxième fluorochrome qui émet donc sa propre longueur d'onde.