Elles sont intracellulaires obligatoires et peuvent survivre un an dans les fèces des bovins et sur le sol.
Ces bactéries se rencontrent dans la nature où elle vivent en saprophytes, mais également chez l'Homme et les animaux où elles se comportent soit en commensales soit en pathogènes. Quelques espèces sont pathogènes strictes pour l'homme et d'autres pour l'animal.
Les mycobactéries pathogènes strictes sont responsable de maladies spécifiques:
Ce sont des aérobies strictes, parfois microaérophiles à l'isolement. Elles sont très résistantes à la dessiccation allant jusqu'à quelques années de survie à l'état desséché et au froid. Les mycobactéries résistent aux antiseptiques hydrosolubles (mais sont sensibles aux produits liposolubles, comme alcool, éther). Elles résistent aux enzymes des phagocytes (les lysosomes ne contiennent que peu de lipases). On observe chez les mycobactéries un ralentissement des échanges nutritifs : alors que la plupart des microbes pyogènes se divisent une fois toutes les 10 à 20 minutes, le bacille tuberculeux se divise une fois toutes les 10 à 20 heures tandis que celui de la lèpre se divise une fois tous les 20 jours. Ceci explique le caractère beaucoup plus lent et chronique des mycobactérioses.
Le génome de Mycobacterium tuberculosis a été entièrement séquencé : elle possède un chromosome circulaire de 4 411 529 paires de bases (GC%=65.6) pour 3924 gènes.
Un gène particulier semble essentiel au pouvoir pathogène chez l'Homme, gène absent chez le BCG et Mycobacterium microti. Il s'agit d'un gène codant une protéine ESAT-6, sécrétée par la bactérie et déclenchant une forte production d'interféron-Gamma, à l'origine de tests diagnostics récents.
Les mycobactéries se différencient fondalementalement par leurs caractères structuraux :
Les cultures se présentent généralement comme des colonies mates, peu bombées, irrégulières et d'aspect sec : de type Rough. Les Mycobacterium tuberculosis présentent une irrégularité atypique : elle est dite en « chou-fleur ».