Du 30 octobre au 10 novembre 2002 De Winne a participé à la mission Odissea, un vol de soutien à la station spatiale internationale. Il a été l'ingénieur de vol sur le nouveau vaisseau spatial Soyouz TMA pendant montent, et sur Soyouz TM pendant la ré-entrée. Une des tâches principales de la mission 11 jours était le remplacement du véhicule TM-34 Soyouz attaché à la station spatiale par le nouveau vaisseau spatial TMA-1, afin de fournir un « canot de sauvetage » frais; pour l'équipage résident à employer en cas d'urgence. Pendant ses neuf jours à bord de la station spatiale, De Winne, dont le vol a été commandité par les Services fédéraux belges des affaires scientifiques, techniques et culturelles (OSTC), (OSTC), a effectué avec succès un programme de 23 expériences dans des domaines très variés : biologie, sciences de la vie et sciences des matériaux, y compris des expériences avec le Microgravity Science Glovebox (MSG) conçu et développé en Europe.
L'astronaute aidé par ses collègues russes a étudié notamment l'effet du rayonnement cosmique et de la microgravité sur les cellules de mammifères, afin de comprendre le vieillissement cellulaire, responsable des maladies d'Alzheimer et de Parkinson.
Frank De Winne a été désigné le 11 février 2008 pour la prochaine mission de longue durée à bord de la station spatiale internationale (ISS), en qualité de commandant. Il passera six mois à bord en 2009 en tant que membre de l'Expédition 19.Il y réalisera des expériences qui devront plus nous informer à certaines réactions dans l'espace.
Le 27 mai 2009, il décolle donc (avec le cosmonaute russe Roman Romanenko et l'astronaute canadien Robert Thirsk) à bord d'un véhicule russe Soyouz de Baïkonour, au Kazakhstan, pour une mission de six mois à bord de la Station spatiale internationale ( ISS).
Au cours de cette mission, le 10 octobre, il est devenu le premier commandant européen de l'ISS.
Son retour sur Terre s'effectue le 1er Décembre 2009, près de Arkalyk, au Kazakhstan, par le biais d'une capsule Soyouz TMA-15.
Il fut élevé au rang de vicomte par SM le roi Albert II de Belgique en 2006.