Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes - Définition

Introduction

Le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par resonance de type Förster (FRET, pour l'acronyme anglais "Förster resonance energy transfer"), bien qu’observé par Perrin au début du XX^e siècle, est décrit pour la première fois par Förster en 1946. Les applications de cette approche à l’étude des interactions protéiques apparaîtront vers la fin du XX^e siècle (Selvin, 2000).

Figure 1. Conditions du FRET. A. Un FRET peut apparaître seulement si le spectre d’émission du donneur recouvre le spectre d’excitation de l’accepteur. Ce recouvrement est défini par une intégrale de recouvrement J. B. Un FRET est observé si la distance séparant les deux fluorophores est inférieure à 1.8 x le rayon de Förster (R₀ ). Ce dernier définit la distance donneur – accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50%. C. Importance de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur pour la mise en place d’un transfert d’énergie.

Caractéristiques photophysiques d'un fluorophore

Une molécule capable d’émettre un signal de fluorescence est qualifiée de fluorophore. Différentes caractéristiques photophysiques permettent de le définir :

- les spectres d’excitation et d’émission. Ils représentent la signature de la structure énergétique du fluorophore. La différence de longueur d’onde séparant leur maximum s’appelle le déplacement de Stokes.

- le coefficient d’extinction molaire (ε). Il correspond à la capacité d’absorption par le fluorophore de l’énergie apportée par un photon à une longueur d’onde donnée.

- le rendement quantique (Φ). Il caractérise la capacité du fluorophore à re-émettre sous forme de lumière, l’énergie absorbée. Il est défini comme étant le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés.

- la durée de vie de fluorescence (τ). Elle représente le temps de séjour moyen du fluorophore dans son état excité.

Voir aussi l'article sur la fluorescence.

Conditions du transfert d’énergie

D’après la théorie de Förster, le FRET est défini comme un transfert d’énergie non radiatif (sans émission de lumière) résultant d’une interaction dipôle – dipôle entre deux molécules (donneur et accepteur d’énergie) (Stryer, 1978). Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d’émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d’absorption de l’accepteur (Figure 1.A). Ce recouvrement des spectres est défini par une intégrale appelée intégrale de recouvrement J(λ) :

où f_D est l’intensité de la fluorescence émise par le donneur à une longueur d’onde donnée et ε_A le coefficient d’extinction molaire de l’accepteur. Le facteur J reflète donc la capacité d’une paire de fluorophores à émettre et absorber de l’énergie à la même longueur d’onde.

En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur, comme le montre la formule suivante :

où R est la distance effective qui sépare les deux molécules et R₀ le rayon de Förster. Ce dernier correspond à la distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50% (Figure 1.B). Cette distance, qui dépend de la nature des fluorophores utilisés, est généralement comprise entre 1 et 10 nm (Stryer and Haugland, 1967). Au-delà de cette gamme, l’efficacité du transfert d’énergie chute très rapidement. L’expression mathématique pour le calcul de cette distance s’écrit :

où J est l’intégrale de recouvrement, n l’indice de réfraction du milieu (n ^{− 4} est généralement compris entre 1/3 et 1/5), Q_D le rendement quantique du donneur en absence d’accepteur et κ² le facteur d’orientation qui est fonction de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur (Figure 1.C). Même si la valeur de κ² est théoriquement comprise entre 0 et 4, 2/3 est la valeur habituellement utilisée pour déterminer le R₀. En effet, κ² est assimilé à 2/3 lorsque le donneur et l’accepteur présentent un degré de liberté suffisant pour être aléatoirement orientés dans l’espace (Stryer, 1978). Cette condition est généralement satisfaite pour les fluorophores attachés à des biomolécules car ils peuvent avoir une certaine liberté de rotation (Dale et al., 1979).