Immunoprécipitation - Définition

Progrés technologiques

Agar–agar

Historiquement, le support en phase solide le plus couramment utilisé par les scientifiques est constitué de billes d'agar–agar extrêmement poreuses. L'avantage de cette technique est sa très forte capacité de couplage par la quasi totalité de la structure en forme d'éponge de la bille d'agar–agar qui est disponible pour lier les anticorps qui, à leur tour, se lieront aux protéines à étudier. Ce très haut pouvoir de couplage doit être précisément équilibré par la quantité d'anticorps que l'expérimentateur va utiliser pour enrober les billes d'agar–agar. Comme les anticorps sont coûteux, il vaut mieux procéder à l'envers et déterminer d'abord la quantité de protéines que l'on veut étudier (selon le type d'expérience conduit) et de calculer ensuite la quantité d'anticorps nécessaire, avec un léger excès, car les anticorps ne sont pas absolument tous actifs. Il faut aussi déterminer la quantité exacte d'agar–agar à mettre en œuvre pour capturer les anticorps, et pas plus. Dans l'éventualité où le coût des anticorps est sans importance, cette technologie devient inadaptée en raison de sa capacité à capturer de très grandes quantités de protéines. Son principal intérêt se transformant alors en inconvénient. Le problème apparaît lorsque de grandes quantités de billes d'agar–agar ne sont pas entièrement saturées par les anticorps. Il arrive souvent que la masse d'anticorps disponible pour une immunoprécipitation soit inférieure à celle qui serait nécessaire pour saturer la totalité des billes d'agar–agar. Dans ce cas l'expérimentateur terminera sa manipulation avec des billes d'agar–agar qui n'auront pas été enrobées par des anticorps, et qui, par conséquent, seront susceptibles de se lier avec « n'importe quoi ». On aura donc un nombre important de protéines non–spécifiques liées aux billes ce qui introduira un bruit de fond élevé rendant difficile l'interprétation des résultats. Pour ces raisons il vaut mieux adapter avec précision la quantité d'agar–agar nécessaire (en termes de pouvoir de liaison) à la quantité d'anticorps que l'on veut voir se lier au cours de l'immunoprécipitation.

Présélection

Dans la plupart des cas, il est recommandé d'introduire dans le processus une étape supplémentaire au début de chaque immunoprécipitation : la présélection (voir l'étape 2 de la section « Mode opératoire » ci–dessous). La présélection consiste à introduire des billes d'agar–agar non enrobées au mélange de protéines pour lier les protéines non spécifiques qui restent libres dans la solution. Les billes introduites pour la présélection seront éliminées après une période d'incubation convenable. Par cette manipulation, on essaie d'extraire du mélange de protéines les billes d'agar–agar liées à des protéines non spécifiques si bien que lorsque l'on ajoutera les billes enrobées d'anticorps, le nombre de liaisons non spécifiques sera réduit.

Billes superparamagnétiques

On peut également utiliser comme support des billes superparamagnétiques de tailles et de caractéristiques uniformes qui présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux billes d'agar–agar polydispersées. Un de ces avantages est leur capacité à se lier avec des complexes de protéines de très grande dimension avec une absence totale de limite. Ceci est dû aux différences inhérentes à chaque technique. Là où les billes d'agar–agar ont une porosité d'éponge et ont des tailles différentes, les billes magnétiques sont petites, solides, sphériques et de taille uniforme (dans le cas de billes monodispersées). Étant donné que le pouvoir de liaison des anticorps est uniquement situé à la surface solide des billes, la totalité du couplage des protéines se fera à la surface éliminant, du coup, toute limite supérieure de taille. Ceci doit être mis en regard avec les billes d'agar–agar qui ont un pouvoir de couplage important mais ne peuvent pas lier des complexes de protéines de grande taille à l'intérieur des pores microscopiques de la bille. Une autre caractéristique du couplage limité à la surface réside dans la vitesse de couplage car les complexes de protéines n'ont pas à pénétrer à l'intérieur des pores pour se lier.

Un inconvénient potentiel lié à la technique des billes magnétiques et qu'elles ne peuvent pas rivaliser, en termes de pouvoir de couplage, avec les billes d'agar–agar, comme cela a été évoqué ci–dessus. Encore que ceci peut être un inconvénient ou un avantage selon que l'utilisateur de l'agar–agar souhaite ou non ajouter suffisamment d'anticorps pour saturer le pouvoir de couplage des billes. Si on ne met pas en œuvre l'énorme quantité d'anticorps nécessaire pour obtenir ce résultat, les billes restantes pourront se lier à des peptides ou des protéines non spécifiques conduisant à des résultats difficiles à interpréter.

Chez certains fabricants, le coût des billes magnétiques est très compétitif par rapport à celui de l'agar–agar. Un calcul sommaire classique comparant les coûts respectifs des deux méthodes peut donner les billes magnétiques comme plus onéreuses, mais ceci est souvent le résultat d'un calcul erroné. Cette erreur vient de ce qu'on divise la capacité de couplage (qui est très importante avec l'agar–agar) par le coût du produit. En effet dans ce type de raisonnement on tient compte de la quantité de billes d'agar–agar théoriquement nécessaire, et non pas de celle, en large excès, qui est utilisée en réalité en immunoprécipitation. Au cours de la manipulation, l'usage des billes d'agar–agar nécessite la mise en œuvre d'une quantité minimale pour chaque immunoprécipitation. Ceci parce que les billes d'agar–agar doivent être concentrées par centrifugation dans le culot du tube et le liquide surnageant éliminé après chaque période d'incubation, chaque lavage, etc. Il y a donc une limite physique absolue car en–deçà d'une certaine quantité de billes d'agar–agar il est impossible de les identifier dans le culot du tube. Ce minimum de matière à mettre en œuvre a évidemment une incidence importante dans le calcul du prix de revient, si bien que les billes magnétiques peuvent rivaliser avec les billes d'agar–agar, d'autant plus qu'il est possible d'adapter exactement leur quantité à la quantité d'anticorps.

Quelques utilisateurs de billes magnétiques ont remarqué un problème avec les billes magnétiques de certains fabricants dont une partie (avec les protéines qui les recouvrent) ne migrait pas vers l'aimant au cours de l'immunoprécipitation. Ce problème connu avec les billes polydispersées de quelques fournisseurs ne se présente pas avec des billes monodispersées uniformes puisque leurs propriétés sont toutes semblables.

La capacité de couplage des billes magnétiques globalement assez faible permet plus facilement de faire correspondre la quantité d'anticorps nécessaire avec le pouvoir de couplage global ce qui diminue considérablement les liaisons avec des éléments non–spécifiques et, par conséquent, les fausses réponses positives. L'augmentation de la vitesse de réaction au cours de l'immunoprécipitation en utilisant les billes magnétiques permet un meilleur rendement avec les complexes de protéines labiles (instables) en raison de la réduction de la durée du processus et du nombre de manipulations diminuant ainsi le stress physique de l'échantillon et son temps d'exposition aux protéases ce qui contribue à augmenter le rendement, en termes de protéines identifiées, dans les complexes quand on réalise l'immunoprécipitation sur des complexes de protéines. L'immunoprécipitation par la technique des billes d'agar–agar peut également être accélérée par l'utilisation de petites colonnes à centrifuger pour contenir la résine d'agar–agar, et en prélevant rapidement les éléments non liés ou en « lavant » la solution après une brève centrifugation.