Immunoprécipitation - Définition

Introduction

L'immunoprécipitation est la technique qui permet la précipitation d'un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement une protéine particulière. On l'utilise pour isoler et concentrer une protéine précise parmi des milliers d'autres. L'immunoprécipitation impose que l'anticorps se trouve en milieu solide à certaines étapes du traitement.

Diverses immunoprécipitations

Immunoprécipitation d'une protéine

L'immunoprécipitation permet l'isolation d'une protéine dans une solution en contenant beaucoup d'autres. Il peut s'agir d'un lysat brut de tissus bilogiques végétaux ou animaux, de fluides corporels ou d'autres produits aqueux d'origine biologique.

Immunoprécipitation d'un complexe de protéines

L'immunoprécipitation d'un complexe de protéines repose sur la sélection d'un anticorps correspondant à une protéine qu'on suppose faire partie du complexe. L'agglutination de cette protéine rend en principe possible l'extraction de tout le complexe auquel elle appartient, et donc l'identification des autres protéines qui le composent. Il faut pour cela que les protéines soient suffisamment liées pour que l'extraction de l'une d'entre elles entraîne l'ensemble du groupe sans provoquer sa dissociation. Cette technique est souvent utilisée en biologie moléculaire pour analyser les interactions protéine–protéine.

Plusieurs précipitations avec différents anticorps sont souvent nécessaires pour identifier les différentes protéines d'un complexe. En effet, un anticorps sélectionne souvent une sous–population des protéines recherchées selon la visibilité de l'épitope, ne « voyant » pas les protéines du complexe dont l'épitope est masqué. Ceci se vérifie par le fait qu'un anticorps précipite le plus souvent moins de la moitié des protéines cibles, même s'il est en net excès dans la solution. De plus, une première immunoprécipitation permet souvent d'identifier de nouvelles protéines du complexe étudié. L'expérimentateur va alors choisir des anticorps spécifiques des nouvelles protéines trouvées et va répéter l'ensemble de la manipulation qui doit révéler d'autres protéines du complexe. En répétant l'opération, le nombre de protéines trouvées continuera d'augmenter. Les différentes protéines identifiées peuvent ne pas exister toutes ensemble dans un seul complexe, mais être des protéines qui interagissent entre elles à différents moments, pour différentes raisons. Enfin, la répétition de la manipulation à la recherche de nouvelles protéines permet aussi d'opérer un contrôle des résultats : chaque précipitation doit permettre de trouver, à la fois, la protéine de départ, celles qui ont été trouvées dans les précipitations précédentes, et éventuellement, de nouvelles protéines. L'expérimentateur peut ainsi s'assurer de la validité de ses conclusions. Si une protéine particulière n'apparaît que lorsqu'on la cible spécifiquement, et pas lorsqu'on cible les autres protéines, se pose la question de la réalité de son appartenance au complexe.

Immunoprécipitation de la chromatine

L'immunoprécipitation de la chromatine est une méthode qui permet de déterminer les sites de liaison de l'ADN sur le génome pour une protéine particulière et donne accès à une représentation des interactions protéine–ADN qui ont lieu dans le noyau de la cellule vivante ou dans les tissus. La mise en œuvre in vivo de cette méthode est bien différente de celles qui sont généralement utilisées.

Le principe à la base de ce procédé est que les protéines qui se lient à l'ADN (y compris les facteurs de transcription et les histones) peuvent être réticulées avec l'ADN auquel elles sont liées. En employant un anticorps spécifique d'une protéine présumée liée à l'ADN, on peut faire une immunoprécipitation du complexe protéine–ADN du lysat cellulaire. La réticulation s'obtient souvent par l'action du formaldéhyde sur les cellules (ou les tissus), encore qu'il soit parfois plus intéressant d'utiliser un réactif plus approprié comme le DTBP (peroxyde de di-tert-butyle). Après la réticulation, les cellules sont lysées et l'ADN est scindé en morceaux de 0,2 à 1 kb (kilobase) de longueur à l'aide d'un sonicateur. À ce stade, on procède à l'immunoprécipitation pour obtenir des complexes protéine–ADN purifiés. Ces complexes purifiés sont alors chauffés pour annuler la réticulation par le formaldéhyde et l'ADN peut être séparé des protéines. L'identification et le dénombrement des fragments d'ADN peuvent être obtenus par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une des limites de l'utilisation de la PCR sur des fragments isolés est qu'il faut avoir une idée de la région du génome qui a été ciblée pour pouvoir générer les bonnes amorces par PCR. Cette limite est facilement contournable en clonant l'ADN du génome isolé dans un vecteur plasmidique et en utilisant ensuite des amorces spécifiques de la zone de clonage de ce vecteur. En revanche, quand on veut déterminer où la protéine est liée sur un génome à grande échelle, on peut utiliser une puce à ADN (Chip on chip) qui permet la détermination du cistrome. De la même manière, le chip–sequencing, une technologie nouvelle, permet de localiser les sites de liaison à cadence élevée, ce qui est très rentable en termes de coût.

Immunoprécipitation de l'ARN

Assez semblable à l'immunoprécipitation de la chromatine, l'immunoprécipitation de l'ARN concerne les protéines liées à l'ARN au lieu de celles liées à l'ADN. L'immunoprécipitation de l'ARN est aussi une technique in vivo dans laquelle on utilise également le formaldéhyde pour créer des réticulations entre l'ARN et les protéines liées à l'ARN. Ensuite, les cellules sont lysées et on procède à l'immunoprécipitation avec un anticorps adapté à la protéine que l'on souhaite étudier. En isolant la protéine, l'ARN sera également isolé puisqu'il est lié à la molécule par réticulation. Le complexe protéine–ARN purifié peut-être séparé par destruction de la réticulation, et l'identification de l'ARN peut-être obtenue par séquençage de l'ADN ou RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction).

Protéines marquées par des étiquettes

Un des problèmes majeurs de l'immunoprécipitation est la difficulté de disposer d'anticorps spécifiques à une seule protéine. Pour contourner cet obstacle, plusieurs équipes de recherche ont mis au point des techniques de marquage soit de l'atome de carbone (C), soit de l'atome d'azote (N), terminal de la protéine étudiée. Un des avantages du procédé est qu'une seule étiquette peut permettre la précipitation de protéines différentes avec le même anticorps. L'intérêt de cette méthode est tel qu'elle a supplanté les autres techniques d'immunoprécipitation, y compris celles décrites ci-dessus. Parmi les étiquettes le plus couramment utilisées, on peut citer la protéine fluorescente verte, le glutathion-S-transférase (GST) et le Flag-tag.
Alors que la méthode de l'étiquette convient tout-à-fait pour permettre des dépliages, elle introduit quelques difficultés en termes de pertinence biologique parce que l'étiquette peut occulter des interactions naissantes ou, à l'inverse, induire des réactions anormales.