En 1906, Chagas retourne à Rio de Janeiro et rejoint l'Institut Oswald-Cruz, où il travaillera le reste de sa vie. En 1909, il est envoyé par l'Institut dans la petite ville de Lassance, à côté du Rio São Francisco, pour combattre un début d'épidémie de malaria parmi les travailleurs d'une nouvelle voie de chemin de fer reliant la ville de Belém dans l'Amazone. Il y reste les deux années suivantes et observe rapidement la curieuse infestation des maisons rurales par un insecte hématophage du genre Triatoma, une sorte de « punaise assassine » ou punaise « embrassante » (barbeiro ou "barbier" en portugais, appelé ainsi parce qu'il suce le sang la nuit en mordant le visage de ses victimes). Il découvre que les intestins de ces insectes contiennent un protozoaire flagellé, une nouvelle espèce du genre Trypanosoma, et est capable de prouver expérimentalement qu'il peut être transmis à des ouistitis mordus par un insecte infecté. Chagas nomme ce nouveau parasite Trypanosoma cruzi en l'honneur de Oswaldo Cruz et plus tard cette année Schizotrypanum cruzi puis à nouveau Trypanosoma cruzi.
La forte présence de l'insecte vecteur dans les habitations et sa capacité à mordre les humains laissent à penser, selon Chagas, que le parasite pourrait être la cause de maladies humaines. Il fait ainsi des prélèvements sanguins et, le 23 avril 1909, découvre pour la première fois le même parasite dans le sang d'une petite fille de trois ans. Il observe également des inclusions parasitiques dans le cerveau et le myocarde, ce qui peut expliquer un certain nombre de manifestions cliniques chez les personnes malades. Il termine de plus la proposition de cycle de vie du parasite en suggérant que le tatou pouvait être son réservoir naturel. Afin de compléter son travail sur la pathologie de la nouvelle maladie, Chagas décrit 27 cas de la phase aiguë de la maladie et réalise plus de 100 autopsies sur des patients victimes de la phase chronique.
Son travail en protozoologie et en médecine tropicale lui vaut rapidement une renommé aussi bien locale qu'internationale. Élu à l'Académie nationale de médecine, il reçoit le 22 juin 1912 le prestigieux prix Schaudinn, devant d'autres brillants scientifiques comme Paul Ehrlich (1854-1915), Émile Roux (1853-1933), Ilya Mechnikov (1845-1916), Alphonse Laveran (1845-1922), Charles Nicolle (1866-1936) ou Sir William Boog Leishman (1865-1926) (nombre d'entre eux ont déjà ou obtiendront le prix Nobel de médecine).
Chagas est également le premier à découvrir un genre de champignon parasite, Pneumocystis, dans les poumons des animaux infectés par le trypanosome sur lesquels il mène ses expériences. Mais sur le moment, il ne le distingue pas comme un organisme différent de T.cruzi et rassemble les deux organisme sous le genre Schizotrypanum, accommodant de ce fait les deux cycles biologiques. Mais, cette découverte amène d'autres scientifiques à une investigation plus poussée et finalement à décrire Trypanosoma comme un genre distinct de Pneumocystis, maintenant classé parmi les fungi. Chagas, suit de près la littérature spécialisée et confirme rapidement la distinction, adoptant à nouveau le nom Trypanosoma cruzi donné à l'origine. Pneumocystis est actuellement lié à une autre maladie, la pneumocystose, causée par une espèce (P. jirovecii).