Nightingale fut accueillie en héroïne à son retour en Grande-Bretagne le 7 aout 1857. D'après la BBC, elle fut de toute évidence la victorienne la plus célèbre après la Reine Victoria elle-même. Elle déménagea de la résidence de sa famille à Middle Claydon, dans le Buckinghamshire, pour s'installer au Burlington Hotel à Piccadilly. Elle fut frappée de fièvre, probablement due à une forme chronique de brucellose (fièvre criméenne), qu'elle contracta lors de la Guerre de Crimée, possiblement combinée à un syndrome de fatigue chronique[citation nécessaire]. Elle interdit à sa mère et à sa sœur d'entrer dans sa chambre et ne la quitta que rarement.
En réponse à une invitation de la Reine Victoria, et malgré les contraintes imposées par son confinement dans sa chambre, Nightingale joua un rôle central dans l'établissement de la Commission Royale pour la Santé de l'Armée, dont Sidney Herbert devint président. En tant que femme, elle ne put être nommée à la Commission, mais rédigea le rapport de plus de mille pages de cette dernière incluant des rapports statistiques détaillés, et joua un rôle décisif dans l'application de ses recommandations. Le rapport de la Commission conduisit à une révision majeure des soins dispensés aux soldats, et à l'établissement d'une école de médecins militaires et d'un vaste système d'archives médicales de l'armée.
La contribution la plus célèbre de Nightingale survint lors de la Guerre de Crimée, qui devint son centre d'attention lorsque des rapports commencèrent à atteindre la Grande-Bretagne au sujet des conditions épouvantables des blessés. Le 21 octobre 1854, Nightingale et un groupe de 38 infirmières volontaires formées par elle-même et incluant sa tante Mai Smith, furent envoyées (sous l'autorisation de Sidney Herbert) en Turquie, à environ 545 kilomètres de Balaclava en Crimée, de l'autre côté de la mer Noire, où était basé le camp britannique.
Nightingale arriva début novembre 1854 à la Caserne Selimiye à Scutari (aujourd'hui Üsküdar à Istanbul). Les infirmières trouvèrent des soldats blessés négligés par un personnel médical débordé face à l'indifférence des officiers. Les réserves de médicaments étaient limitées, l'hygiène négligée et les infections de masse courantes, la plupart d'entre elles étant fatales. Il n'y avait également aucun équipement pour préparer la nourriture des patients.
Nightingale et ses compatriotes commencèrent par nettoyer complètement l'hôpital et l'équipement, et par réorganiser les soins des patients. Cependant, pendant son séjour à Scutari, le taux de mortalité ne diminua pas ; au contraire, il se mit à augmenter. Le nombre de morts dépassa celui de tous les autres hôpitaux de la région. Pendant son premier hiver à Scutari, 4077 soldats y trouvèrent la mort. Dix fois plus de soldats moururent de maladies telles que le typhus, la fièvre typhoïde, le choléra et la dysenterie que de blessures de combat. Les conditions régnant à l'hôpital militaire temporaire étaient fatales aux patients à cause du surnombre, d'égouts défectueux et d'un manque de ventilation. En mars 1855, le gouvernement britannique dut envoyer une commission sanitaire à Scutari, près de six mois après l'arrivée de Nightingale. Les égouts furent nettoyés et la ventilation améliorée, et le taux de mortalité diminua rapidement.
Nightingale continua de penser que le taux de mortalité était dû à la médiocrité de l'alimentation et des réserves, ainsi qu'au surmenage des soldats. Ce n'est qu'après son retour en Grande-Bretagne et avoir rassemblé des informations auprès de la Commission Royale pour la Santé de l'Armée qu'elle se mit à penser que la mort de la plupart des soldats hospitalisés était due aux mauvaises conditions de vie. Cette expérience influença sa carrière, et par la suite elle défendit l'importance des conditions de vie sanitaires. Elle contribua ainsi à réduire le nombre de morts au sein de l'armée en temps de paix et dirigea son attention vers la conception sanitaire des hôpitaux.