En ce qui concerne l’œuvre scientifique, il faut associer le nom de Tiffeneau à ceux de son condisciple Fourneau et de leur maître Béhal. Ce dernier initie les deux étudiants aux théories nouvelles et signera avec Tiffeneau de nombreux travaux. Quant au premier, il devient le camarade d'étude, l'ami, le beau-frère et le collaborateur de Tiffeneau. Tous deux appartiennent à cette génération de chercheurs qui vont renouveler les méthodes de la chimie organique et ouvrir ainsi la voie de la chimiothérapie moderne, tant du point de vue théorique, par intérêt pour la structure atomique des molécules, que pratique, par souci de travailler de concert avec l'industrie. Fourneau et Tiffeneau assistent ensemble avec enthousiasme au cours libre de Béhal sur la théorie et la notation atomiques ; Fourneau commence sa carrière aux établissements Poulenc frères et Tiffeneau débute la sienne dans le laboratoire des Fabriques de produits de chimie organique De Laire. Leur communauté de pensée se concrétise dans la Molécule, groupement de jeunes chimistes fondé en 1903 par les deux camarades, auxquels se joignent Marcel Delépine, Edmond Blaise, Armand Valeur, Marcel Sommelet et, par la suite, des industriels comme Camille Poulenc, Francis Billon ou François Albert-Buisson. La Molécule contribuera à résoudre les difficultés rencontrées par la Société chimique de France après la guerre de 1914.
L’œuvre de Tiffeneau touche aux domaines les plus divers de la chimie organique pure et de la chimie organique appliquée à la pharmacologie et à la pathologie.
En chimie pure, Tiffeneau a travaillé toute sa vie sur les transpositions moléculaires, c’est-à-dire sur les déplacements d’atomes ou de groupements d’atomes à l’intérieur d’une molécule. Il a répertorié, classé et coordonné ces migrations, appliquant les résultats de ses recherches à l’étude des relations entre la constitution des molécules et leurs propriétés. Ses apports dans ce domaine sont d’un nombre et d’une importance considérables. Il a notamment donné son nom à une variation du réarrangement de Demjanov (découvert par le chimiste russe Nikolai Demjanov) : le réarrangement de Tiffeneau-Demjanov. Il s'agit d'une réaction entre un 1-aminomethyl-cycloalkanol et de l'acide nitrique pour donner une cétone cyclique.
En chimie pharmacologique et en pharmacodynamie, Tiffeneau a étudié les hypnotiques (acides barbituriques, glycols, uréides bromés, etc), les anesthésiques généraux et locaux, les amines analeptiques et sympathomimétiques. Tant par la transformation d’alcaloïdes naturels, dont la nicotine, que par la synthèse d’alcaloïdes nouveaux, principalement dans les séries de l’hordénine et de l’adrénaline, il a contribué à la mise au point de nombreux médicaments. Il en a d’autre part identifié et contrôlé beaucoup d’autres. Ses études de chimie pathologique ont porté principalement, mais non exclusivement, sur la métabolisation du chloralose et sur la toxicité de la tuberculine.