Peu de temps après la publication, on propose à Vésale le poste honorifique de médecin impérial à la cour de Charles Quint. Il informe le Sénat de Venise qu'il quitte son poste à Padoue, ce qui incite Cosme Ier de Médicis, grand-duc de Toscane à l'inviter à venir développer l'université de Pise qui était alors en déclin. En 1544, il passe à Bologne, à Pise et il accepte de devenir le chirurgien de l’empereur Charles Quint puis de Philippe II d'Espagne. Dans ses fonctions à la cour, il doit affronter les moqueries des autres médecins qui le traitent avec le mépris dû à un barbier.
Il se marie avec la fille d'un notable bruxellois et pour le reste de sa vie, il devint le médecin des grands, il suit les déplacements de la cour, soigne les blessures de guerres ou de tournois, réalise des interventions chirurgicales et des autopsies, et écrit des lettres personnelles pour résoudre des problèmes particuliers sur des questions d'ordre médical. Avec Ambroise Paré Il fut même appelé au chevet roi de France Henri II, blessé à l’œil par une lance lors d’un tournoi et qui devait décéder quelques jours plus tard.
En 1546, il publie ses recherches sur l'influence de la racine de Chine contre la goutte dans un court texte intitulé Radicis Chynae. Il recommande l'usage de cette plante, avec autant de vigueur ainsi qu’il défendait auparavant ses découvertes en anatomie. Cela suscite une nouvelle série d'attaques contre son œuvre, qui fait alors l’objet d’une demande de condamnation auprès de l'empereur. En 1551, Charles V saisit une commission à Salamanque pour enquêter sur les implications religieuses de ses méthodes. Le travail de Vésale est autorisé par le conseil, mais les attaques se poursuivent. Quatre ans plus tard, un de ses principaux détracteurs publie un article qui prétend que c’était le corps humain lui-même qui avait changé depuis l’époque où Galien l’avait étudié (et donc le maître ne s’était pas trompé).
Après l'abdication de Charles, il reste à la cour auprès de son fils Philippe II qui le tient en grande estime et le récompense par une pension à vie et fait de lui un comte palatin. En 1555, il a publie une édition révisée de De Corporis.
En 1564 Vésale se rend en pèlerinage en Terre Sainte. Il navigue avec la flotte vénitienne sous les ordres de James Malatesta par la route de Chypre. À son arrivée à Jérusalem, il reçoit un message du Sénat de Venise lui demandant à nouveau d'accepter le poste de professeur à Padoue, qui était devenu vacant à la suite de la mort de son ami et élève Gabriele Falloppio.
Lors du voyage de retour, après avoir lutté des jours durant contre un vent défavorable en mer Ionienne, son bateau fait naufrage et Vésale finit par mourir d'épuisement sur les côtes de l’île de Zante (Zakynthos) le 15 octobre 1564 où il fut rejeté par les matelots. Il meurt, dans un tel état de dénuement que, si un bienfaiteur n'avait pas payé ses funérailles, sa dépouille aurait été jetée aux animaux. Au moment de sa mort, il était à peine âgé de cinquante ans.
Pendant de nombreuses années, on a supposé que le pèlerinage de Vésale a été imposé par une condamnation de l'Inquisition. Aujourd'hui, cette hypothèse est généralement considérée comme étant sans fondement et est rejetée par les biographes modernes. Il semble que cette calomnie ait été diffusée par Hubert Languet, qui avait servi Charles-Quint, puis le prince d'Orange. Il a affirmé en 1565 qu’au cours d’une autopsie sur une femme de l’aristocratie en Espagne Vésale aurait constaté que le cœur battait encore, ce qui lui avait valu une condamnation à mort par l'Inquisition. L'histoire prétend que Philippe II aurait transformé la sentence en pèlerinage forcé à Jérusalem. L'histoire a de nouveau fait surface à plusieurs reprises au cours des années qui ont suivi, persistant jusqu'à une époque récente.