Chromatographie en phase liquide à haute performance - Définition

Grandeurs caractéristiques en chromatographie

Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la forme d'une courbe du signal détecté en fonction du temps : c'est le chromatogramme. Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caractéristiques différentes :

• le temps de rétention ou t_R, temps du maximum du pic. On appelle t₀ ou temps de rétention nulle le temps correspondant à un composé non retenu chromatographiquement.
• la largeur du pic, mesurée à mi-hauteur : ω_1/2, ou à sa base, par l'intersection des tangentes du pic à ses points d'inflexion avec la ligne de base : ω.

De là peuvent être calculées plusieurs caractéristiques de la colonne pour la séparation des pics :

• le facteur de rétention k' du pic, par la formule

• l' efficacité N ou nombre de plateaux théoriques, reliée à la largeur du pic par la formule

Cette valeur mesure la finesse du pic. À partir de cette valeur peut être calculée la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) H, qui permet de comparer des colonnes de longueur différente

• la sélectivité α entre deux pics 1 et 2 (2 étant plus retenu que 1), définie par le rapport de leurs deux facteurs de rétention

Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics. Plus elle est supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés.

• la résolution R_S entre les pics 1 et 2

Cette valeur mesure la qualité de séparation et d'absence de recouvrement entre les 2 pics considérés.

La résolution ainsi définie est l'objectif de la séparation chromatographique. C'est une fonction des trois caractéristiques (efficacité, sélectivité et rétention), elles-mêmes définies ci-dessus, dont l'expression est

Cette expression montre notamment qu'une même résolution peut être obtenue dans des conditions chromatographiques ou bien très efficaces (optimisation cinétique) ou bien très sélectives (optimisation thermodynamique). Quoi qu'il en soit, la performance qui caractérise la technique HPLC est définie par le pouvoir de résolution par unité de temps, ce qui n'implique pas systématiquement l'utilisation de la pression la plus haute possible.

Paramètres de chromatographie

La qualité et la durée d'une séparation peuvent changer avec la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile utilisées. Mais pour un même type de phase stationnaire et une même phase mobile, la qualité et la durée d'une séparation peuvent aussi être modifiées par les caractéristiques géométriques et opératoires de ces deux phases.

Caractéristiques géométriques de la phase stationnaire

• la longueur L et le diamètre interne d_c de la colonne
• le diamètre des particules de phase stationnaire d_p

Caractéristiques opératoires de la phase mobile

• la vitesse linéaire de l'écoulement u
• la perte de charge ou pression appliquée ΔP entre l'entrée et la sortie de la colonne (la pression de sortie étant généralement atmosphérique). Elle est donnée par la loi de Darcy

où η est la viscosité de la phase mobile et Φ est le facteur de résistance à l'écoulement qui dépend de la forme des particules et de la qualité du remplissage de la phase stationnaire.
Pour des colonnes bien remplies de particules sphériques ou irrégulières, la formule empirique suivante, établie avec les unités usuelles, permet le calcul commode d'une estimation de ΔP en fonction du débit F de la phase mobile avec une incertitude inférieure à 25%



Remarque : la loi de Darcy est à l'hydraulique ce que la loi d'Ohm est à l'électricité. La pression hydraulique est analogue au potentiel électrique, le débit de liquide est analogue à l'intensité du courant, la perméabilité hydraulique est analogue à la conductivité électrique, la pressurisation et la dépressurisation d'une colonne chromatographique sont respectivement analogues à la charge et à la décharge d'un condensateur électrique.