La sonde fut lancée depuis Cap Kennedy le 14 juin 1967 par une fusée Atlas SLV-3/Agena D, deux jours après le départ de la sonde russe Venera 4.
Lors de l'injection sur trajectoire interplanétaire depuis son orbite d'attente, on visa largement à côté de Vénus afin d'être sûr de ne pas la percuter et éventuellement contaminer son environnement. La télémétrie confirma ensuite que la sonde passerait à environ 67 000 km de sa cible. La correction eut lieu le 19 juin et rapprocha sa trajectoire à environ 4 000 km de la surface. La sonde gardait encore la possibilité de faire une seconde correction, mais cela ne fut pas nécessaire.
Le 19 octobre 1967, lendemain de la descente de l'atterisseur soviétique Venera 4, Mariner entama son survol de Vénus et passa au plus près à 4 094 km d'altitude à plus de 30 000 km/h. L'occultation du signal de la sonde par la planète dura 20'51". Les mesures qu'elle enregistra furent envoyées vers la Terre en différé après le survol.
La masse de la planète incurva la trajectoire de Mariner encore plus vers l'intérieur du système solaire, et après le survol, elle devint l'artefact ayant le plus faible périhélie, s'approchant le 4 janvier 1968 à 87 millions de kilomètres du Soleil.
L'orientation de l'antenne parabolique et l'éloignement grandissant firent perdre le contact radio en novembre 1967.
La sonde n'ayant subi aucune avarie, sa mission fut étendue afin d'enrichir les connaissances de l'époque en matière de mécanique céleste et de conception de sonde. On décida donc de renouer le contact avec elle à partir de juillet 1968, mais le signal de la sonde ne fut réacquis que 3 mois plus tard, instable et inexploitable. Après trois semaines d'efforts infructueux, les opérations furent terminées.