Séquençage des protéines - Définition

Détermination de la composition d'une protéine en acides aminés

Rupture des ponts disulfure

La rupture des ponts disulfure entre les cystéines est avant tout une dénaturation chimique, qui est de plus essentielle pour pouvoir séparer les différents groupes d'acides aminés. On utilise à cet effet des agents réducteurs porteurs de fonctions thiol (–SH), comme le 2-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (réactif de Cleland). Il existe également des réducteurs non-thiolés comme le TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine). Il faut savoir également que deux cystéines sont réunies par leur groupement thiol (–SH), et forment alors une molécule appelée cystine. La cystéine est un acide aminé, elle peut donc être dénaturée. Le pont disulfure est responsable de la structure tertiaire des protéines, apportant une grande stabilité a cette dernière.

Hydrolyse des liaisons peptidiques

L'hydrolyse des liaisons peptidiques permet de séparer les différents acides aminés, car elles sont responsables de la structure primaire, agissant entre le groupement cétone d'un acide aminé (C=O) et le groupement amine (NH2) d'un AA (acide aminé) voisin.

• Hydrolyse totale acide :
  • Utilisation d'acide chlorhydrique (HCl) à 6 mol/L à chaud (110°C) et pendant 24h environ.
  • L'hydrolyse acide totale détruit le tryptophane et transforme en acide les fonctions amides de la glutamine et de l'asparagine pour donner du glutamate et de l'aspartate.

• Hydrolyse totale alcaline:
  • Utilisation d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 4 mol/L à chaud (110°C) pendant 24h environ.
  • L'hydrolyse totale alcaline détruit la sérine, la thréonine, la cystéine.

L'hydrolyse totale acide détruisant moins d'acides aminés, elle est en conséquence la méthode d'hydrolyse la plus utilisée.

Analyse de l'hydrolysat

Après rupture des liaisons disulfures au 2-mercaptoéthanol et une hydrolyse, l'hydrolysat est déposé sur une résine échangeuse d'anions ou de cations. Une fois les fractions récupérées on les colore à la ninhydrine et on mesure l'absorbance à 570nm. On obtient finalement une estimation du pourcentage de chaque acide aminé contenu dans la chaîne (% de résidus alanine,...). La détermination de cette composition n’est pas nécessaire pour déterminer la séquence et est de fait de moins en moins pratiquée.