Séquençage des protéines - Définition
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Introduction
Le séquençage des protéines est la détermination de la séquence polypeptidique. Elle est destinée à connaître le nombre, la nature chimique et l'ordre de tous les résidus d'acides aminés dans un polypeptide. Pour cela, si la protéine contient plus d'une chaîne polypeptidique, les chaînes doivent être d'abord séparées, puis purifiées. Généralement, toutes les liaisons disulfures seront réduites et les thiols ainsi obtenus alkylés. Après isolement d'une chaîne polypeptidique, la séquence peut être étudiée:
- en faisant appel à des méthodes récurrentes chimiques ou enzymatiques libérant les acides aminés un à un à partir de l'extrémité C ou N terminale;
- ou plus récemment par des méthodes de spectrométrie de masse (séquençage de novo).
Le séquencage des protéines est plus difficile que celui de l'ADN.
Historique
C'est dans les années 50 que Frederick Sanger et les chercheurs de l'Université de Cambridge ont déterminé la séquence des acides aminés qui composent l'insuline. Pour cela, plutôt que d'hydrolyser complètement l'hormone, ils ont utilisé des enzymes catalysant la coupure des polypeptides au niveau de sites spécifiques. Les fragments résultants ont été séparés par chromatographie, puis partiellement hydrolysés pour donner un nouveau groupe de fragments. À ce stade, Sanger utilisa des méthodes chimiques pour déterminer la séquence des acides aminés. À partir des séquences obtenues il rechercha des chevauchements afin de reproduire la séquence initiale. Il fallut plusieurs années à Sanger pour reconstituer la structure primaire de l'insuline. Depuis, la plupart des étapes du séquençage des protéines ont été automatisées. Actuellement le séquençage des protéines a été largement délaissé au profit de celui des acides nucléiques (ADN principalement et ARN), plus rapide et plus performant.
La dénaturation
La dénaturation est une désorganisation de la structure spatiale sans rupture des liaisons peptidiques, car seules les liaisons secondaires sont concernées.
Conséquences de la dénaturation
- Perte de l'activité biologique
- Changement des propriétés optiques
- Perte de la solubilité car précipitation
Les agents dénaturants
Ils sont nombreux et peuvent être physiques ou chimiques.
Les agents dénaturants physiques
- Température : Toute augmentation de la température provoque une rupture des liaisons hydrogène.
- Modification de pH : Elle entraîne une modification des charges portées par les groupements ionisés, d'où une rupture de ces liaisons.
Les agents dénaturants chimiques
- L'urée et le SDS (détergent) : Rupture les liaisons hydrogène.
- Le β mercaptoéthanol et l'acide performique : Rupture des ponts disulfures.
- Les bases et détergents provoquent une forte dénaturation protéique.
- Les défécants : Précipitation des protéines (défécation)
- Le bromure de cyanogène (BrCN) : clive la méthionine.
Importance de la dénaturation
In vitro : pour les extractions d'enzymes, on évite les dénaturations. Mais pour une stérilisation, on les provoque.
C'est également en faisant agir des dénaturants sur des protéines que l'on va pouvoir les séquencer.
Les structures
Chaque protéine est une macromolécule constituée par l'enchaînement de molécules de masse moléculaire plus petite appelées monomères : les acides aminés.
La structure primaire
Les acides aminés (AA) s'assemblent grâce à des liaisons peptidiques (groupement cétone d'un AA avec le groupement amine d'un AA voisin → C=O—NH2), et forment ainsi la structure primaire.
La structure secondaire
La structure secondaire peut se manifester sous deux formes:
- Élément A : L'hélice α (en spirale – exemple : la kératine). Ce sont les protéines fibreuses.
- Élément B : Le feuillet plissé β (en escalier – exemple : l'hémoglobine). Ce sont les protéines globulaires.
Cette structure est due à l'existence de liaisons hydrogène qui se forment entre des liaisons peptidiques voisines.
La structure tertiaire
Soit le feuillet plissé β, soit l'hélice α s'assemblent en structure tertiaire par des liaisons secondaires qui se créent entre les radicaux des acides aminés qui, lors de la formation de la structure secondaire, se sont retrouvés à l'extérieur de la structure (exemples : liaison saline, hydrogène, pont disulfure). Ces liaisons, hormis le pont disulfure qui est une liaison covalente forte, sont des liaisons covalentes faibles.
Ce repliement de la chaîne peptidique amène la création d'un site actif responsable de l'activité biologique de la protéine.
La structure quaternaire
Certaines protéines, dites oligomériques (constituées par plusieurs chaînes de polypeptides – chaque chaîne présente une structure primaire, secondaire et tertiaire), telle que l'hémoglobine par exemple, atteignent une structure quaternaire en adoptant une construction symétrique et paire par l'association de ces différents protomères. Ces protéines ne voient la création de leur site actif que lorsque cette structure a été atteinte.
