Microscope de fluorescence par réflexion totale interne
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Le microscope de fluorescence par réflexion totale interne est un type particulier de microscope optique à fluorescence permettant d'examiner une tranche très fine d'un échantillon (moins de 200 nm d'épaisseur), grâce à un mode d'illumination particulier : la réflexion totale interne (En optique géométrique, un rayon lumineux traversant une séparation entre deux milieux d'indices optiques différents peut subir une réflexion et une réfraction. Lorsqu'il n'y a pas de rayon réfracté, on dit qu'il subit une...). Il fait partie de la famille de microscopes en champ (Un champ correspond à une notion d'espace défini:) proche.

En biologie (La biologie, appelée couramment la « bio », est la science du vivant. Prise au sens large de science du vivant, elle recouvre une partie des sciences naturelles et de...) cellulaire, un grand nombre (La notion de nombre en linguistique est traitée à l’article « Nombre grammatical ».) d'évènements moléculaires intervenant à la surface (Une surface désigne généralement la couche superficielle d'un objet. Le terme a plusieurs acceptions, parfois objet géométrique, parfois frontière physique, et est souvent...) des cellules comme par exemple l'adhésion (En physique, l'adhésion est l'ensemble des phénomènes physico-chimiques qui se produisent lorsque l’on met en contact intime deux matériaux, dans le but de créer une résistance mécanique...) cellulaire, la fixation d'hormones sur des récepteurs de la membrane plasmique, la sécrétion de neurotransmetteurs ainsi que la dynamique (Le mot dynamique est souvent employé désigner ou qualifier ce qui est relatif au mouvement. Il peut être employé comme :) membranaire (endocytose, exocytose) ont étés étudiés en microscopie (La microscopie est l'observation d'un échantillon (placé dans une préparation microscopique plane de faible épaisseur) à travers le microscope. La microscopie permet de rendre visible des éléments invisibles à...) de fluorescence (La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes d'excitation autres que la chaleur. (on parle parfois de « lumière froide »). Elle peut servir à caractériser un matériau.) conventionnelle ou confocale. Cependant, il existe un état d'équilibre entre les molécules fluorescentes qui se lient à la surface du spécimen et celles présentes dans son environnement (L'environnement est tout ce qui nous entoure. C'est l'ensemble des éléments naturels et artificiels au sein duquel se déroule la vie humaine. Avec les enjeux écologiques actuels, le terme...) immédiat. Lorsque ces molécules sont excitées et leur fluorescence détectée par un microscope conventionnel, la fluorescence provenant des molécules liées est mélangée avec la fluorescence provenant des molécules libres qui sont généralement largement excédentaires.

La microscopie de fluorescence par réflexion interne (En France, ce nom désigne un médecin, un pharmacien ou un chirurgien-dentiste, à la fois en activité et en formation à l'hôpital ou en cabinet...) totale (TIRFM) permet de surmonter ce problème. Le principe de cet appareil est de n'exciter la fluorescence que sur une très faible profondeur, immédiatement adjacente à l'interface (Une interface est une zone, réelle ou virtuelle qui sépare deux éléments. L’interface désigne ainsi ce que chaque élément a besoin de connaître de l’autre pour pouvoir...) verre (Le verre, dans le langage courant, désigne un matériau ou un alliage dur, fragile (cassant) et transparent au rayonnement visible. Le plus...) (support de l'échantillon)/eau (milieu environnant l'échantillon). L'excitation est due à une onde évanescente (Les ondes évanescentes apparaissent de façon générale comme des solutions possibles des équations de Maxwell en présence d'interfaces, planes ou non. Elles font partie d'un type très...). Celle-ci est générée uniquement quand la lumière (La lumière est l'ensemble des ondes électromagnétiques visibles par l'œil humain, c'est-à-dire comprises dans des longueurs d'onde de 380nm (violet)...) incidente est totalement réfléchie à l'interface verre / eau (L’eau est un composé chimique ubiquitaire sur la Terre, essentiel pour tous les organismes vivants connus.), ce qui ne se produit que pour un certain angle (En géométrie, la notion générale d'angle se décline en plusieurs concepts apparentés.) d'incidence : l'angle critique, c'est la réflexion totale (En optique géométrique, un rayon lumineux traversant une séparation entre deux milieux d'indices optiques différents peut subir une réflexion et une réfraction....) interne. L'échantillon (De manière générale, un échantillon est une petite quantité d'une matière, d'information, ou d'une solution. Le mot est utilisé dans différents domaines :) est alors soumis à un champ électromagnétique (Le champ électromagnétique est le concept central de l'électromagnétisme. On le conçoit souvent comme composition des deux champs vectoriels que l'on peut mesurer indépendamment : le champ électrique E et le champ...) sur une faible profondeur au delà de la surface(environ 200 nm). L'intensité d'excitation de la fluorescence décroît exponentiellement en fonction de la distance par rapport à la surface. On peut ainsi en TIRFM visualiser de manière très sélective les régions de contact de la cellule avec son support (membrane basale). Il est ainsi possible d'étudier avec une très grande résolution la morphologie ou les évènements intervenant à la membrane plasmique de cellules vivantes.

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