La loi a suscité la vive réaction de certaines organisations étudiantes et des personnels d'université et un mouvement d'opposition dans de nombreuses universités et lycées, pouvant se traduire par des grèves.
La Conférence des présidents d'université, qui regroupe les présidents d'universités et des directeurs d'instituts et d'écoles, s'est déclarée à la majorité favorable à la loi. Dans une tribune du journal Le Monde, 7 des 9 présidents d'université de Paris ont rappelé que la loi présentait selon eux des « avancées décisives » et constituait un « élan nouveau » pour les universités. Selon sept présidents d'université, « briser cet élan serait une régression dramatique pour [les] établissements ». Jean-Robert Pitte considère pour sa part que la loi va dans l'« intérêt même des étudiants ». Toutes les voix ne sont cependant pas concordantes : Pascal Binczak, le président de l'université Paris VIII, a affirmé à plusieurs reprises son opposition à la loi.
A l'inverse de la majorité des présidents d'université, les syndicats des professeurs de l'enseignement supérieur et les conseils centraux se sont majoritairement opposés à la loi. Pour Jean Fabbri, secrétaire général du Snesup, principal syndicat des enseignants-chercheurs (MCF et PR)« ce texte ne correspond pas aux priorités de l'enseignement supérieur et de la recherche » ; « l'université a avant tout besoin de moyens supplémentaires ». Le mouvement de lutte des personnels a pris ensuite de nouvelles formes (vote dans les CA contre la loi, un grand nombre de CNU s'y est également opposé...) avant de s'essouffler.
SUD éducation, SUD Recherche EPST, CNT Supérieur-Recherche, CNT Fédération des Travailleurs de l'Education et la FERC SUP CGT demandent l'abrogation de la loi LRU.
L'UEC (Union des étudiants communistes) s'est tout de suite prononcé pour l'abrogation de cette loi car celle-ci s'oppose, selon elle, au développement d’un enseignement supérieur public et démocratisé permettant la réussite de tous, place l’université au service des besoins du marché et affaiblit la démocratie universitaire. l'UEC a aussi dénoncé la spécialisation à outrance de la 3e année de Licence qui aurait comme conséquence une redéfinition des savoirs enseignés et évoqué son inquiétude face à une possible secondarisation du premier cycle et face à l’absence d’un véritable statut pour les stagiaires. Enfin, L'UEC a, à de nombreuses reprises, pris position contre la répression orchestrée contre le mouvement étudiant pour l'abrogation de la LRU.
L'opposition à la loi a fait l'objet d'une pétition, dite « Appel des Cordeliers », selon laquelle en dépit des objectifs affichés, la loi aurait pour objet de « recomposer le paysage universitaire en instituant des mécanismes concurrentiels entre universités et entre individus en réduisant l’expression et le contrôle démocratique, à l’opposé d’une logique de service public ». La concentration de plus de pouvoirs dans les mains du président d'université, notamment à travers les articles 15 et 16 qui lui permettent de recruter « pour une durée déterminée ou indéterminée des agents contractuels […] pour assurer […] des fonctions d'enseignement ou de recherche », ou le fait que le CEVU et le CS deviennent purement consultatifs, sont perçus comme un danger : ainsi, selon le mouvement Sauvons la recherche, certains dispositifs du projet de loi constituent un « premier pas vers la restauration du mandarinat ».
Le 20 novembre 2008, l'Association des directeurs d'IUT (ADIUT) lance une pétition contre la réforme du financement des IUT que la loi LRU doit imposer. Une journée de mobilisation est organisée dans les 116 IUT de France le 25 novembre 2008, afin de lutter contre la réforme de l'attribution des moyens alloués par l'État aux IUT. Selon la LRU, ces moyens devraient en effet être remis aux universités au lieu d'être accordés directement aux IUT, ce qui risquerait, selon l'ADIUT, d'engendrer de graves disparités entre les différents IUT de France, et de provoquer l'asphyxie financière d'un bon nombre d'IUT.
Le statut des enseignants-chercheurs est aussi un motif d'inquiétude.
Le monde de l'entreprise appelé à jouer un rôle plus important par les fondations a exprimé son soutien à la loi LRU et son inquiétude vis-à-vis des slogans très anti-patronaux exprimés lors de certains blocages d'universités tandis que Laurence Parisot parle de « malentendus et de clichés ».
La loi a été soutenue par l'Union pour un mouvement populaire, le Nouveau Centre et le Mouvement démocrate. Le Parti socialiste s'est dit favorable au « principe de l'autonomie » tout en demandant des garanties financières tandis que le Parti communiste français et Les Verts demandaient l'abrogation de la loi.
D'autres organisations de gauche non représentées à l'Assemblée nationale demandaient aussi l'abrogation de la loi. Notamment la Ligue communiste révolutionnaire et Lutte ouvrière.