PCR en temps réel - Définition

Définition

La réaction en chaîne par polymérase en temps réel est une technique ayant de nombreuses applications, basée sur une réaction enzymologique, la PCR et sur la mesure en continu de son produit.
Il existe différents appareils de PCR en temps réel.
A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. L’obtention de la cinétique complète de la réaction de polymérisation permet d’obtenir une quantification absolue de la quantité initiale d’ADN cible, ce qui était très difficile à obtenir sans biais en PCR en point final. Du point de vue enzymatique, il n’y a aucune différence théorique entre ces deux types de PCR. Vous êtes donc invité à consulter la page générale sur la Réaction en chaîne par polymérase . Grâce à l'extraordinaire puissance de la technique d'amplification de l'ADN par PCR, il est possible aujourd'hui d'établir un profil génétique à partir de quantités infimes d'ADN.

Pourquoi quantifier en nombre de cycles?

La différence fondamentale de la PCR en temps réel avec la PCR en point final est que l’intégralité de la cinétique mesurable (au-dessus du bruit de fond) est quantifiée. Les données de fluorescence peuvent donc être exprimées en logarithme afin d’identifier facilement la phase exponentielle et mesurable, qui prend alors une apparence linéaire. Cette partie, alors appelée « segment quantifiable », permet de calculer la quantité d’ADN initial.

Graphique de gauche (A) :

Les cinétiques de PCR théoriques de trois échantillons (K, L et M) de concentration d’ADN initial décroissantes (considérons d’un facteur 10 à chaque fois) sont représentées dans un repère semi logarithmique. Les mesures du bruit de fond ou trop influencées par lui (phase 1 et 2 d’une cinétique mesurable de PCR) ne sont pas représentées.

(1) Zone des segments quantifiables de chaque échantillon (phase 3 d’une cinétique mesurable de PCR). Les autres phases sont représentées en gris et n’ont pas d’intérêt pour ce chapitre.

(2) Chacun des segments quantifiables permet de définir une équation de type Y = aX + B. Cette équation de droite modélise la phase exponentielle de la PCR après transformation logarithmique, même la partie qui n’est pas mesurable à cause du bruit de fond. Les phases exponentielles des échantillons K, L et M sont représentées respectivement par les droites pleines bleu marine, turquoise et mauve. La pente « a » est dérivée de l’efficacité de PCR. Puisque le même amplicon est détecté pour chaque échantillon, c’est une constante et les droites sont parallèles. L’ordonnée à l’origine « B » correspond à la quantité d’ADN au cycle 0. La modélisation du segment quantifiable permet donc théoriquement de déterminer directement la quantité d’ADN initial.

(3) En réalité, les mesures expérimentales ont toujours une erreur, aussi faible soit-elle, par définition imprédictibles et répondant à des phénomènes stochastiques. Si des échantillons de concentrations K, L et M étaient amplifiés plusieurs fois, on obtiendrait autant de cinétiques différentes, bien que très proches (leurs segments quantifiables sont respectivement représentés en rouge, rose et orange). Chacune de ces mesures permet d’établir une nouvelle équation de droite représentée en pointillés de la même couleur. Différents ordonnés à l’origine (B) sont alors mesurés. On considérera que les deux droites représentées pour chaque échantillon représentent l’erreur maximum de la technique. La différence entre leurs B (EK, EL et EM) représente donc l’incertitude de la mesure pour chaque échantillon. Cette incertitude est considérable. Dans l’exemple, elle est suffisante pour que l’on puisse mesurer L plus concentré qu K ou M que L mais en réalité, elle est souvent bien plus grande que cela (deux à quatre ordres de grandeur).

(4) Remarquez que l’incertitude sur la mesure n’est pas identique pour chaque échantillon (EK est inférieure à EL, elle-même plus petite que EM). Une projection de l’équation de droite sur l’axe des ordonnées ou une de ses parallèles donne une incertitude concentration d’ADN initial dépendante.

Graphique de droite (B) :

(1) Les équations déterminées à partir des segments quantifiables peuvent être extrapolées jusqu’à l’axe des abscisses, même si on obtient un point mathématique sans réalité biochimique.

(2) Les droites modélisant l’erreur expérimentale (en pointillés et rouge, orange ou rose) permettent alors de définir de nouvelles incertitudes EK, EL et EM. Remarquez que ces incertitudes sont plus grandes que dans le graphique (A) mais de taille identique entre elles. L’erreur sur la mesure est donc devenue concentration d’ADN initial indépendante (3).

(4) Il est possible de projeter les équations de droite sur une parallèle à l’axe des abscisses coupant les segments quantifiables par le milieu. Ce segment sera appelé « seuil de détection ».

(5) Les valeurs en X (en nombre de cycles) de ces intersections sont généralement nommés CT (de l’anglais Cycle Threshold pour "cycle du seuil"), mais parfois aussi CP (de l’anglais Crossing Point pour "point de croisement"). Ce sont des valeurs mathématiques définies sur l’espace des réels positifs et non des entiers positifs (bien qu’une fraction de cycle n’ait aucune réalité expérimentale). Ces valeurs sont inversement proportionnelles à la quantité d’ADN initial, et l’incertitude sur la mesure est minimisée au maximum (en général inférieur à 5%).

La quantification en passant par une valeur mathématique en nombre de cycle (CT) permet donc d’obtenir des résultats fiables, mais n’est pas exploitable directement. Afin d’obtenir la quantité d’ADN initial, il va falloir réaliser de nouvelles transformations mathématiques qui nécessitent de connaître l’efficacité de PCR. Cette dernière est généralement déterminée grâce à une gamme d’étalonnage.