Puce à ADN - Définition

Fabrication

Image 3D Sarfus d'une biopuce à ADN

La puce est une plaque de petite taille environ 6 cm x 3 cm sur laquelle sont fixés des brins monocaténaires (un seul brin au lieu des deux habituels) d'ADN, chacun correspondant au brin complémentaire d'un ARN messager (ARNm). Il peut être fixé sur une puce plusieurs dizaines de milliers de fragments d'ADN (donc autant de gènes dont on peut étudier l'expression).

Chez la société Agilent, le dépôt des sondes sur la lame se fait de manière similaire à celle de l'impression à jet d'encre. De cette manière, des robots spotteurs, avec leurs multiples pointes, déposent par rangées d'infimes gouttelettes d'une solution d'ADN (d'où le terme anglais microarray, « microtableau ») à des positions spécifiques de la puce (adresses). L'ADN est ensuite séché et traité de manière à ce qu'il se fixe sur la puce.

Les ARNm (provenant des gènes exprimés) sont extraits de la cellule à analyser et des fluorochromes sont fixés sur les bases. Puis le mélange témoin marqué et traité marqué est versé sur la puce : chaque brin d'ADNc va s'hybrider au brin monocaténaire d'ADN qui lui est complémentaire pour former un double brin. La plaque est ensuite lavée par des bains spécifiques pour éliminer les brins d'ADNc ne s'étant pas hybridés car non complémentaires de ceux fixés sur la lame.

Elle est ensuite scannée au laser et une image de la puce est créée : chaque fois qu'il y a eu hybridation, le fluorochrome fixé sur l'ARNm a émis dans la longueur d'onde du laser et cela est visible par un point de couleur (rouge pour des fluorochrome émettant dans le rouge...) Les puces à ADN peuvent être fabriquées par des techniques diverses qui incluent l'impression sur des plaques de verre à l'aide de pointes, la photolithographie à l'aide de caches, de micro-miroirs, d'impression par jet d'encre, d'électrochimie sur des puces micro-électroniques.

Les puces à ADN peuvent être utilisées pour détecter les ARN qui seront ou pas traduits en protéines. Les scientifiques parlent d'analyse d'expression ou de profil d'expression. Puisque des dizaines de milliers de sondes sont fixées sur une puce, chaque hybridation sur une puce renseigne autant qu'un nombre équivalent de tests de génétique quantitative. Les puces à ADN constituent ainsi une approche massive et ont contribué à la révolution de la génomique. Le premier profil d'expression par puce à ADN a été publié en 1995 dans le magazine américain Science. Le premier génome eucaryote fixé sur une puce fut celui de la levure (Saccharomyces cerevisiae) ; ce profil d'expression a été publié en 1997 dans la revue Science.

Image d'une hybridation sur une puce à ADN

Rappel : la puce à ADN contient les sondes ADN (oligonucléotides ou ADNc) fixées sur le support.

Marquage des ADNc

Grâce à des fluorochromes, marqueurs d'ADN qui fluorescent sous un laser, on peut marquer des ADNc provenant de la rétrotranscription d'ARNm. En pratique, deux lots d'ADNc correspondant à deux traitements différents (par exemple, lot 1 en vert : ADNc de plantes témoins non traitées; lot 2 en rouge : ADNc de plantes inoculées avec un agent pathogène) sont colorés par deux fluorochromes différents. Ces deux lots sont ensuite mélangés puis hybridés sur la puce à ADN. L'hybridation dure entre 15 et 20 heures selon l'organisme que l'on étudie (bactérie, plante, tissu humain...)

Spécificité de l'hybridation

Suivant la stringence de la solution destinée à laver la puce, l'hybridation entre les lots d'ADNc et les sondes sera plus ou moins spécifique.

Comment les analyse-t-on ?

Une image haute résolution est obtenue grâce à des scanners très haute résolution (2 microns actuellement). Des logiciels interprètent l'intensité des pixels de chaque point de la puce contenant une séquence d'un gène différent et en déduisent une mesure numérique de l'expression de chaque gène proportionnelle à la présence du gène dans les cellules au moment de l'extraction d'ARN. Une puce peut contenir jusqu'à 1 million de "spots" c'est-à-dire un million de gènes ou parties d'un gène ! Si le lot d'ADNc n°1 (plantes non traitées) est marquée en vert et que le lot d'ADNc n°2 (plantes traitées) est marquée en rouge alors :

• Les gènes dont l'expression est augmentée suite au traitement apparaissent alors en rouge et peu en vert sous un laser.
• Les gènes peu affectés par le traitement apparaissent en vert.
• Les gènes dont l'expression est stable entre les deux conditions apparaissent en jaune (rouge + vert).
• Les gènes peu exprimés n'apparaissent pas.

Et aussi...

Il existe deux grandes familles de puces à ADN, l'une ne pouvant recevoir qu'un échantillon de cellule par plaque (mais pouvant contenir beaucoup plus de gènes fixés sur la plaque) et l'autre pouvant recevoir deux échantillons différents, chacun labellisé avec un fluorochrome de couleur différente : sur l'image, un point vert sera donc un gène exprimé dans la cellule saine tandis qu'un point rouge sera un gène exprimé dans la cellule malade. Un point jaune est exprimé dans les deux cellules et un point noir dans aucune...

Il existe aussi de très récentes puces à protéines qui permettent d'étudier le protéome d'une cellule donnée. Ce sont cette fois-ci des antigènes qui sont fixés sur la plaque.