Le trioxyde d'arsenic est très toxique, la dose mortelle est de 0,1 g. Tous les composés d'arsenic contenant des traces de ce produit sont également très dangereux. Il est carcinogène et facilement absorbé par le système digestif; ses effets toxiques sont bien établis en cas d'inhalation de fumée ou de contact cutané entraînant des risques de dermatite ou d'hyperkératose. Son élimination est rapide (durée de vie: 1 à 2 jours) par méthylation en acide cacodylique via les urines. Cependant, une certaine quantité de produit (30 à 40%) en cas d'exposition chronique), est stockée par les os, les muscles, la peau, les cheveux et les ongles (tissus riches en kératine et éliminé dans les semaines ou les mois qui suivent.
Les premiers symptômes de l'empoisonnement aigu par l'ingestion d'arsenic sont des problèmes digestifs : vomissements, paralysie, douleurs abdominales et diarrhées sanguinolentes. Des quantités proches de la dose mortelle peuvent conduire à des convulsions, à des troubles cardiovasculaires, à l'inflammation du foie et des reins et à des troubles de la coagulation sanguine.
Ces symptômes sont suivis de l'apparition des 'lignes' blanches caractéristiques (raies de Mees) sur les ongles et de la perte de cheveux. Les doses inférieures engendrent des changements de la pigmentation de la peau. On sait que des cas d'empoisonnement graves se sont produits après inhalation d'anhydride arsénieux ou par contact avec la peau. Les premiers signes montrent une irritation de la région respiratoire ou de la peau exposée, suivis par des troubles neurologiques à long terme. On doit éviter le contact avec les yeux de solutions (même diluées) d'anhydride arsénieux.
L'exposition chronique à l'arsenic est un facteur de risque de cancer du poumon constaté sur des ouvriers travaillant dans des fonderies de cuivre aux USA, Japon et Suède. En effet, l'anhydride arsénieux est présent dans les fumées qui se forment lors du chauffage à l'air des minerais arsénifères.
L'absorption continue d'eau contenant de l'anhydride arsénieux conduit à des cancers de la peau.