Une des principales nouveautés de Bioshock 2, c'est son mode multijoueur qui s'intègre au scénario pendant la chute de Rapture. Le joueur incarne un chrosôme sollicité par Augustus Sinclair, le directeur du laboratoire Sinclair Solutions, pour tester ses nouveaux plasmides et fortifiants génétiques.
Tous les réglages relatifs au multijoueur peuvent se faire via un appartement de la ville, dans lequel le joueur n'est pas armé. Un appareil stocke les messages audio trouvés dans le mode solo, une armoire permet de modifier l'apparence multijoueur du personnage, et on peut y entendre des messages d'avertissement pour le roleplay. Une petite salle avec une bathysphère permet de se connecter aux différents lobbys de jeu.
Le jeu utilise un système de matchmaking sans serveur dédié.
Le joueur a à sa disposition deux armes avec chacune une amélioration, deux plasmides, et trois fortifiants au choix. Il peut choisir au début du match entre trois sets d'armes/plasmides/fortifiants définis au préalable dans le menu.
La plupart des mécanismes du jeu solo se retrouvent simplifiés en multijoueur. Il est ainsi possible de pirater des tourelles, de ramasser de l'EVE et des munitions qui tombent des distributeurs, de placer une bombe sur ces mêmes distributeurs, ou de faire des recherches sur les cadavres des joueurs adverses pour gagner un bonus de dégâts contre eux, la plupart du temps en appuyant simplement sur un bouton.
On peut gagner des points d'ADAM en tuant, en piratant les machines dispersées dans les arènes, en faisant des tirs d'assistance, etc. Ces points d'ADAM s'accumulent au fil des matchs pour faire monter le joueur en niveau. Monter en niveau débloque de nouvelles armes, de nouveaux plasmides et fortifiants, et de nouveaux défis.
Les défis se débloquent généralement automatiquement dès que le joueur possède le matériel requis pour les accomplir.
Voici les modes de jeu disponibles :
Dans tous les modes de jeu, à part "Capturer la petite sœur", une tenue de protecteur apparaît aléatoirement sur la carte. Le premier joueur à la toucher se transforme en protecteur et devient beaucoup plus puissant et résistant. Il n'a alors plus accès aux plasmides mais a à sa disposition un pistolet à rivets très puissant qui dispose de munitions illimitées (mais il peut surchauffer si on tire trop rapidement) et des grenades collantes(6 en tout) utilisables avec le bouton normalement réservé aux plasmides. Il peut également frapper le sol afin d'étourdir les ennemis dans les alentours et il peut donner un coup de pistolet à rivets pour le corps à corps.