Le luminol peut être synthétisé à partir de l'acide 3-nitrophtalique. De l'hydrazine (N2H4) est d'abord chauffée avec l'acide 3-nitrophtalique dans un solvant à haut point d'ébullition tel que le triéthylène glycol. Une réaction de condensation avec perte d'eau se produit, formant du 3-nitrophtalhydrazide. La réduction du groupe nitrate en un groupe amine avec du dithionite de sodium (Na2S2O4) produit du luminol.
Un oxydant est nécessaire afin de provoquer la luminescence du luminol. Habituellement, une solution de péroxyde d'hydrogène (H2O2) et un sel hydroxyde aqueux est utilisé comme activateur. En présence d'un catalyseur - comme un composé ferreux – le péroxyde d'hydrogène est décomposé en eau et en dioxygène :
2H2O2→O2+2H2O
Dans le cadre d'un laboratoire, le catalyseur utilisé est souvent du ferricyanide de potassium. Pour la détection criminologique de sang, le catalyseur est le fer présent dans l'hémoglobine. Les enzymes de beaucoup de systèmes biologiques sont également susceptibles de catalyser la décomposition de péroxyde d'hydrogène.
Lorsque le luminol réagit avec le sel hydroxyde, un dianion se forme. L'oxygène issu de la décomposition du peroxyde d'hydrogène réagit alors avec ce dianion. Le produit de cette réaction, un peroxyde organique, est très instable et se décompose immédiatement avec une perte d'azote pour produire de l'acide 3-aminophtalique possédant des électrons dans un état excité. La désexcitation des électrons provoque l'émission d'énergie sous forme d'un photon de lumière bleue visible.