Réaction en chaîne par polymérase - Définition
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Efficacité de la PCR
L’avènement de la PCR en temps réel a mis en exergue que l’efficacité d’une réaction de PCR (généralement notée E) n’était pas toujours égale à deux. Cela signifie que sur l’ensemble des cycles considérés comme quantitatif (zone n° 6 de la cinétique), tous les brins matrices ne servent pas forcément à donner une copie complète de l’amplicon. Deux phénomènes en sont les principales causes :
- Tous les brins matrices ne sont pas forcément liés par un complexe amorce/polymérase lors de la phase d’hybridation. La probabilité d’amorçage peut être influencée par la température, la longueur et la séquence de l’amorce, sa composition en nucléotides naturels ou modifiés, sa concentration dans la solution, la composition ionique de cette dernière, l’auto-hybridation entre les amorces ou la compétition possible d’ADN non cible (par exemple un pseudo-gène).
- Toutes les synthèses ne sont pas forcément complètes, notamment si la phase d’élongation est trop courte. Un brin incomplet à son extrémité 3’ ne peut pas servir de matrice car l’amorce complémentaire ne peut pas se lier à lui.
Cette efficacité est donc théoriquement inférieure ou égale à deux mais certaines sources considèrent qu’elle est acceptable jusqu’à 2,3!
Ce qui suit peut être un élément de controverse !
L’auteur de ce chapitre n’a pour l’instant trouvé aucune source justifiant cette position. Il considère qu’il y a deux types d’explication possible :
- Une part significative (jusqu’à 30%) des brins d’ADN servent plusieurs fois de matrice pendant un cycle et cette proportion est conservée pendant toute la phase exponentielle. Donc pour chacune de ces matrices, un complexe amorce/polymérase s’est fixé une première fois, une synthèse complète a été effectuée, l’ADN double brin s’est déshybridé à une température extrêmement défavorable, un second complexe amorce/polymérase s’est fixé à une température probablement défavorable (étape d’élongation) et qu’une seconde synthèse complète a eu lieu.
- Un biais expérimental (dans un facteur de dilution par exemple) ou d’analyse mathématique (généralement commis par l’utilisation inappropriée d’outil d’optimisation présent dans le logiciel du thermocycleur) a été commis. Ces deux types de biais ont été plusieurs fois constatés.
La majorité des protocoles expérimentaux donne une efficacité de PCR entre 1,75 et 2. Deux écoles s’affrontent alors, avec des arguments expérimentaux à l’appui. L’une considère que cette efficacité est une constante pour chaque amplicon dans un protocole expérimental donné. L’autre estime qu’elle varie toujours significativement et qu’elle nécessite d’être constamment remesurée. Il convient de noter qu’il est très difficile de savoir si une variation d’une efficacité de PCR observée vient de la nature même de cette méthode, d’une variation dans le protocole expérimental (manque de reproductibilité des réactifs ou de la manipulation) ou d’une variation dans l’acquisition des données (variations de fluorescence, canaux de lecture différents, biais dans l’analyse mathématique). Il est également très ardu d’être certain que l’efficacité utilisée (mesurée à chaque expérience ou non) est bien celle qui a eu cours dans l’échantillon à calibrer (voir la PCR quantitative.
Le terme efficacité peut aussi avoir deux significations selon les auteurs :
- Les premiers désignent l’ordre de l’exponentielle. L’équation de la cinétique s’écrit donc :
[ADN]n = [ADN]initialexEn
- Les seconds désignent la fraction de molécule d’ADN servant effectivement de matrice. L’équation devient alors :
[ADN]n = [ADN]initialex(1 + E)n
La deuxième formule facilite l’expression en pourcentage (en multipliant E par 100), mais que les deux concepts sont absolument identiques.
Cette efficacité de PCR est un élément fondamental à prendre en compte pour obtenir une mesure quantitative ou établir un protocole de PCR multiplexe, mais elle est généralement négligeable pour un résultat qualitatif ou en PCR en point final.
